교신저자：민경업, 110-744 서울 종로구 연건동 28번지  서울대학교 의과대학 내과학교실
교신저자：전화：(02) 2072-3286 · 전송：(02) 742-3286 · E-mail：drmin@snu.ac.kr
^*저자 현 소속：한림대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실

서     론

   정상인에서 호흡기를 통한 반복적인 항원의 흡입은 특이 IgE-isotype 관용을 유발하여 항원에 대한 과민반응을 일으키지 않지만, 아토피 체질을 가지는 경우는 antigen-specific IgE가 증가되어 알레르기성 염증을 유발한다. 특히 알레르기 비염 및 천식 환자에서의 호흡기 감염은 알레르기성 염증 반응을 더욱 악화시킨다.^1,2,3,4) 호흡기 염증을 일으키는 가장 대표적인 원인 중의 하나로 lipopolysaccharide(LPS)는 주변 환경에서 흔히 접하는 pathogen associated molecular pattern(PAMP)이다. LPS는 각 장기에 존재하는 Toll-like receptor(TLR) 4를 통해 선천면역을 담당하는 효과세포(effector cell)로 하여금 염증을 유도하는 사이토카인을 형성한다.
   알레르기성 기도 질환은 천식과 알레르기 비염이 대표 질환이다. 천식은 기도과민성을 특징으로 하는 기도의 만성 염증성 질환이며 알레르기 비염은 수용성 비루, 코막힘, 재채기를 특징으로 하는 비점막의 염증성 질환으로 천식은 계절성 알레르기 비염과 동반되어 나타나는 경우가 빈번하다.^5,6) 통상적으로 알레르기 비염이 천식의 위험인자로 널리 알려져 있지만 아직 알레르기 비염과 천식에 대한 정확한 기전은 알려지지 않은 상태이다. 또한, 여러 문헌을 통한 알레르기 질환과 LPS와의 연구에 있어서도 일관적인 결론이 도출되지 않고 있다. 동물실험을 통한 알레르기성 기도 질환과 감염에 관한 연구에서 LPS는 알레르기 천식 마우스 모델에서 투여 용량에 따라 알레르기 면역반응을 다르게 유도하였는데 저용량을 투여할 경우 NF-kB를 활성화시켜 GATA1과 GATA2의 발현을 증가시키고 IL-5, IL-13의 생성을 촉진함으로써 T-helper(Th) 2 반응의 호산구성 기도 염증을 증가시키나, 비교적 고용량의 LPS를 투여할 경우에는 Th 1 반응이 증가하는 경향을 보였다.^7,8)
   LPS와 천식과의 연구는 많이 진행되고 있으나 아직 알레르기 비염과 천식을 하나의 기도로서 LPS와의 관계를 연구한 논문은 미비한 상태이다. 이에 난알부민으로 감작시켜 제작한 알레르기 비염 및 천식 마우스 모델에서 동량의 LPS를 상기도 또는 상기도와 하기도에 투여하였을 때 나타나는 기도의 면역반응과 기도과민성을 살펴보았다.

재료 및 방법

실험동물 및 대조군과 실험군 분류
   6주령의 암컷 BALB/c 마우스 29마리를 특정병원체부재(specific pathogen-free：SPF) 동물실험실 시설에서 LPS가 없는 멸균된 사료로 사육하였다. 교내 동물실험운영위원회(IACUC)의 승인을 받았으며 미국 국가조사위원회(National Research Council, U.S.A.)의 실험 동물의 관리와 사용에 관한 지침(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)을 준수하여 실험하였다.
   전신감작(general sensitization)을 위해 실험군에서는 각 마리당 1회 투여 시 면역보조제인 alum hydroxide(alum, Sigma, St. Louis, MO, USA) 2 mg과 난알부민(ovalbumin, grade V, Sigma) 75 μg을 PBS 200 μL에 녹여 실험 0, 7일에 복강으로 투여하였다. 국소자극(local challenge)은 실험 14, 15, 16, 21, 22, 23일에 PBS 30 μL에 OVA 75 μg 또는 OVA 75 μg과 LPS 10 μg을 혼합하여 20 μL 씩 주입하였다. 대조군에서는 전신감작과 국소자극에서 OVA와 LPS 대신 phosphate buffered saline(PBS)을 사용하였다. 각 과정에서 전신마취를 할 경우 xylazine(0.7~1 mg/마리)와 ketamine(0.5~0.75 mg/마리)을 혼합하여 복강으로 투여하였다. 즉, 모든 실험군에서 전신감작시 1회 투여되는 OVA의 용량은 75 μg이며, 국소자극 시 1회 투여되는 OVA의 용량은 50 μg, LPS의 용량은 6.7 μg이었다.
   마우스를 투여 약물 및 국소자극 방법에 따라 다음과 같이 다섯 군으로 분류하였고 해당 군에 1회 투여되는 OVA 및 LPS의 용량은 동일하였다(Table 1). 
   제1군：대조군으로 7마리의 마우스가 포함되었으며 PBS를 복강으로 투여하여 감작시키고 국소자극단계에서는 PBS를 전신마취하에 비강으로 투여하여 상기도와 하기도에 PBS가 들어가도록 하였다. 
   제2군：알레르기 비염 모델로 6마리의 마우스가 포함되었으며, OVA를 복강으로 2회 투여하여 전신감작을 시키고 실험 14, 15, 16, 21, 22, 23일의 국소자극단계에서는 전신마취를 하지 않고 의식하에 비강으로 OVA를 투여하여 비강에만 시약이 들어가도록 자극하였다. 약어로 AR군으로 칭한다.
   제3군：알레르기 비염 및 천식 모델로 6마리의 마우스가 포함되었으며, AR군과 동일한 방법으로 감작 후 같은 일정으로 자극하였다. 자극단계에서 전신마취하에 비강으로 AR군과 동량의 OVA를 투여하여 비강과 폐에 시약이 들어가도록 하였다. 약어로 ASM군으로 칭한다.
   제4군：알레르기 비염 상태에서 상기도 감염만 유도한 모델로 5마리의 마우스가 포함되었으며, AR군과 동일한 방법으로 감작 후 같은 일정으로 자극하였다. 자극단계에서 마취를 하지 않고 의식하에 OVA와 LPS 혼합물을 비강으로 투여하여 비강에만 시약이 들어가도록 하였다. 약어로 AR+ LPS군으로 칭한다.
   제5군：상기도 및 하기도 감염을 유도한 모델로 5마리의 마우스가 포함되었으며, AR군과 동일한 방법으로 감작 후 같은 일정으로 자극하였다. 자극단계에서 전신마취하에 AR +LPS군에서와 같이 동량의 OVA와 LPS 혼합물을 비강으로 투여하여 비강과 폐에 시약이 투여되도록 하였다. 약어로 ASM+LPS군으로 칭한다.
   대조군과 모든 실험군은 실험 24일에 기도저항측정계(single chamber whole body plethysmography for animals, OCP 3000：Allmedicus, Anyang, Korea)를 사용하여 기도과민성을 측정하고, 실험 25일에 모든 동물들을 희생시키고 기관지폐포세척액, 비강세척액, 혈액을 채취하고 비강과 폐 조직을 적출하였다(Fig. 1).

동물용 기도저항측정기를 통한 호흡상수측정 
   마지막 국소자극 24시간 후에 메타콜린(Methacholine, Sigma)에 의한 기도과민성 및 알레르기 증상을 알아보기 위해 기도저항측정계를 이용하여 호흡상수를 측정하였다. 먼저 3분간 흡입기(nebulizer)를 사용하여 메타콜린의 농도를 6.25 mg/mL에서 25 mg/mL까지 증량하면서 흡입시킨 후 기도저항측정계에 연결하여 3분간 30초 간격으로 기도과민성의 지표인 Penh(enhanced pause：Penh=[(Te/RT-1)×(PEF/ PIF)])을 측정하였다.⁸⁾

기관지폐포세척액 및 비강세척액에서의 염증세포수 및 사이토카인 측정
   기도과민성을 측정하고 24시간 후에 무균의 PBS 1 mL 주사기와 26 게이지 혈관주사용 가이드를 이용하여 기관지폐포세척액과 비강세척액을 채취하였으며 원심분리(Cytospin, Shandon, UK)를 실온에서 500 rpm으로 5분간 시행한 후 세포가 있는 슬라이드를 Diff-quick^R(Sysmex Co., Tokyo, Japan)으로 염색하였다. 슬라이드를 말린 후 합성 고정액(Histomount^TM, Ted pella Inc., Redding, CA, USA)으로 고정하고 광학현미경으로 400배 시야에서 상기도 및 하기도 세척액에 포함된 대식세포, 림프구, 중성구와 호산구의 수를 모두 세었다.
   기관지폐포세척액과 비강세척액의 IL-5, IL-13, IFN-γ 측정을 위해 Quantikine Mouse Immunoassay(R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, USA)를 이용하여 ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbant Assay)를 시행하였고 반응을 종결시킨 후 450 nm에서 흡광도(optimal density：OD)를 측정하였다.

혈청 난알부민 특이 항체 측정
   혈청에서 난알부민 특이 IgE, IgG_2a를 ELISA kit(BD OptEIA：BD Biosciences, San Jose, CA, USA)를 이용하여 측정하였다. 10 μg/mL의 난알부민을 각 well당 100 μL씩 분주한 후 4℃에서 overnight 처리하고 3% 소혈청알부민(bovine serum albumin)으로 37℃에서 한 시간 동안 처리하여 비특이적 항원-항체반응을 억제하였다. IgE 측정을 위해 원액의 혈청을, IgG_2a 측정을 위해 1：20으로 희석한 혈청을 각 well당 100 μL씩 투여하고 37℃에서 두 시간 동안 반응시킨 후 세척하였다. Biotin이 부착된 항체(anti-mouse IgE and IgG_2a, BD Biosciences)를 각 well당 100 μL씩 투여하고 37℃에서 한 시간 동안 반응시켰다. Avidin-horseradish peroxidase를 각 well당 100 μL씩 투여한 후 37℃에서 30분간 반응시켰다. O-phenylendiamine dihydrochloride(Sigma)와 3% H₂O₂를 각 well당 100 μL씩 넣고 30분간 반응시키고 12.5% H₂SO₄를 각 well당 50 μL씩 넣어 반응을 종결시킨 후 470 nm에서 흡광도를 측정하였다.

기도 조직 염색
   마지막 국소자극 48시간 후 ketamine과 근육이완제, 식염수를 2：3：5로 혼합한 시약을 복강으로 투여하여 마우스를 희생하였고 포르말린으로 관류 고정한 후 폐, 비강 조직을 적출하여 조직학적 관찰을 위해 10% paraformaldehyde(Samchun pure chemical Co., Pyeongtaek, Korea)에 고정하였다. 고정된 마우스의 두부는 탈석회화한 후 폐조직과 비강 조직을 파라핀 포매 과정을 거쳐 4 μm의 두께로 박절한 후 비강의 경우 비전정에서 7 mm 후방의 절편을 취하여 hematoxylin-eosin(H&E) 염색을 하였다.
   비강에서의 염증세포를 정량화하기 위해 Jacob 등 마우스 비강의 해부에 대한 보고에 근거하여 400배율에서 상악 상비갑개(superior maxillary turbinelle)와 상악 하비갑개(inferior maxillary turbinelle) 사이의 2차 상악동(secondary maxillary sinus)에서의 호산구 세포수를 세고 각 군의 평균값을 비교하였다.⁹⁾
   폐에서의 염증세포 정량화는 400배율에서 적어도 3개의 중기관지(한 기도 내강의 상피세포가 75~150개인 기관지) 주변의 호산구 세포수를 세 평균값을 비교하였다.¹⁰⁾

통계학적 분석
   결과는 mean±SEM으로 표시하였고 모든 통계처리는 SPSS version 12(SPSS Inc, Chicago, IL, USA)를 이용하였다. 각 군과의 비교에서 통계학적 분석은 Mann-Whitney U test를 이용하였으며 통계학적 유의성은 p<0.05를 기준으로 하였다.

결     과

기도과민성
   기도과민성은 모두 메타콜린의 농도가 25 mg/mL일 때의 수치를 기준으로 비교하였다. 기도과민성의 지표인 Penh의 변화는 대조군에 비해 하기도군인 ASM 및 ASM+LPS군과 상기도군인 AR+LPS군에서 통계적으로 유의하게 증가하였다(p<0.05). 상기도염증군 간의 비교에서 AR군에 비해 AR+LPS군에서 기도과민성에 유의한 증가를 보였다(p<0.01). AR+LPS군과 ASM+LPS군 간의 기도과민성 또한 유의한 차이를 보여 하기도까지 염증이 있을 때 기도과민성이 심해짐을 알 수 있었다(p<0.05). 하기도군 간의 비교에서는 기도과민성에 유의한 차이는 없었다(Fig. 2).

기관지폐포세척액 및 비강세척액의 염증세포수
   기관지폐포세척액에서는 ASM+LPS군, ASM군에서 염증세포가 증가하는 양상을 보였으며 나머지 군에서는 염증세포의 침윤이 관찰되지 않았다. 대조군과 비교하였을 때 ASM+LPS군에서 전체 세포수 및 호산구수가, ASM군에서는 호산구수가 통계적으로 의미 있는 차이를 보였다(p<0.01). 비강세척액에서는 대조군과 비교하였을 때 ASM+LPS군에서 염증세포가 증가하였으나 통계적으로 유의하지는 않았다(Fig. 3).

기관지폐포세척액 및 비강세척액의 사이토카인
   IL-5는 기관지폐포세척액에서 ASM군, ASM+LPS군에서 통계적으로 유의하게 증가하였고(p<0.05), 비강세척액에서는 ASM군에서 가장 높은 수치를 보였지만 통계적으로 유의하지는 않았다. IL-13은 기관지폐포세척액에서 ASM군, ASM+LPS군에서 통계적으로 유의하게 증가하였고(p<0.05), 비강세척액에서는 AR+LPS군에서 가장 높은 수치를 보였으나 통계적으로 유의하지 않았다. IFN-γ는 기관지폐포세척액에서 ASM+LPS군이, 비강세척액의 경우 ASM군과 ASM+LPS군에서 수치가 증가하였으나 모두 통계적으로 유의한 차이를 보이지 않았다(Fig. 4).

혈청 난알부민 특이 IgE, IgG_2a
   혈청에서 측정한 난알부민 특이 IgE는 모든 군에서 대조군에 비해 모두 통계적으로 유의하게 증가하였으며 AR군, AR+LPS군 순서로 높은 수치를 나타냈다. 상기도군과 하기도군의 비교에서 하기도군인 ASM군보다는 상기도군인 AR군이, ASM+LPS군보다는 AR+LPS군의 수치가 의미 있게 증가하였다.
   난알부민 특이 IgG_2a에서도 모든 군에서 대조군에 비해 모두 통계적으로 유의하게 증가하였고, ASM군에 비해 AR군과 ASM+LPS군의 수치가 의미 있게 증가하였다(p<0.05, Fig. 5).

폐, 비강에서의 조직 병리 소견
   폐에서 H&E 염색 소견은 대조군과 비교하였을 때 ASM군과 ASM+LPS군에서 기도와 폐포 주변 호산구 세포의 침윤이 유의하게 증가하였고 나머지 군에서는 대조군과 비슷하였다. 비강에서의 H&E 염색 소견은 대조군과 비교하였을 때 모든 군에서 점막하 기질의 호산구 세포 등의 염증세포 침윤이 유의하게 증가하였다(Fig. 7).

고     찰

   마우스 실험에서 전신마취의 유무에 따른 알레르기 비염과 천식을 유도하는 방법은 이미 여러 문헌에서 검증이 이루어졌다. 전신마취를 하여 비강을 통해 주입한 시약은 저항 없는 호흡을 유도하여 기관지를 통해 폐로 들어가 알레르기 비염과 천식을 일으키지만, 마취를 하지 않고 비강으로 주입할 경우 흡인(aspiration)되어 식도를 통해 위로 들어 가게 되고 최종적으로 알레르기 비염만 단독으로 일으키게 된다.^11,12,13,14) 본 연구에서도 마우스에서 난알부민을 복강으로 주입하여 전신 감작을 시키고 전신마취의 유무를 달리하면서 비강을 통해 난알부민과 LPS를 투여하여 알레르기 비염, 천식, LPS로 인한 상기도와 하기도의 알레르기 염증 모델을 만들었다. 본 연구결과에서 알레르기 비염을 유발한 상기도와 알레르기 비염과 천식을 유발한 하기도에서 동량의 LPS를 투여하였을 때 나타나는 면역반응은 항상 상응하여 변화하지는 않았다. 비강과 폐에서의 조직학적 염증 및 염증세포 Th2 type 사이토카인의 경우는 OVA 또는 LPS가 유입된 기도에서만 의미 있는 변화가 있어났으나 전신면역반응인 혈청 난알부민 특이 항체의 증가는 대조군과 비교 시 하기도군(ASM군, ASM+LPS군)보다 상기도군(AR군, AR+LPS군)에서 높은 수치를 나타내어 동량의 LPS에 대한 전신면역반응이 하기도군보다 상기도군에서 증가됨을 알 수 있었다.
   기도과민성은 대조군에 비해 하기도군인 ASM+LPS 및 ASM군과 상기도군인 AR+LPS군에서 통계적으로 유의하게 증가하였고, AR군에서도 통계적으로 의미는 없었으나 기도과민성이 증가하였다. 특히 상기도군에서는 폐의 염증 소견이 없음에도 불구하고 기도과민성이 증가하는 것은 상기도의 알레르기성 염증이 하기도의 기도과민성의 유발인자로 고려할 수 있으며 Saito 등도 이와 비슷한 결과를 보고한 바 있었다.¹³⁾ 가장 흔하게 발생하는 기도과민성은 IgE를 매개로 한 알레르기 반응으로, 원인 항원에 노출된 후 나타나는 기관지 주변의 호산구성 알레르기 염증 반응이 기도과민성의 흔한 원인이라고 알려져 있다. 이러한 기도과민성을 일으키는 직접적인 인자는 histaminem, methacholine 등으로 직접적으로 기관지평활근이 수축하고, 간접적인 인자로는 운동, 과호흡, 찬공기 등이 있으나 이에 대한 정확한 기전은 밝혀지지 않은 상태이다.¹⁵⁾ 기도과민성은 아토피의 가족력이 있으나 천식은 없는 성인의 9.2%, 비염만 있는 성인의 40%에서 동반된다고 알려져 있다. 무증상의 기도과민성을 가지고 있는 28명 중 3년 후 4명에서 천식으로 진행하였다고 보고한 Laprise 등은 그 기전으로 기도과민성을 선두로 하여 점진적인 기도의 염증과 변형이 진행되고 궁극적으로 천식으로 발전하기 때문이라고 주장하였다.¹⁶⁾ 천식의 중요한 특징인 기도과민성은 가역적이고 일시적인 경우에서는 CD4+ T세포에서 분비하는 IL-4, IL-5, IL-13 등의 사이토카인과 호산구 세포에서 분비하는 eotaxin으로 인한 기도염증과 강한 연관성이 있다고 추정되고 있다.^15,17,18,19) 본 연구에서는 상기도 염증군에서 이러한 기도염증이 없음에도 불구하고 기도과민성이 의미 있게 증가하였는데 이러한 결과는 아직 문헌상 보고된 바 없으며 추후 기전을 밝히기 위한 연구들이 있어야 할 것이다.

결     론

   본 연구의 알레르기 비염 및 천식 마우스 모델에서 각 호흡기관에 동량의 LPS를 투여하였을 때 기도과민성은 하기도 염증군뿐만 아니라 폐의 국소 염증이 없는 상기도 염증군에서도 증가하였다. 이러한 결과는 상기도 및 하기도 질환이 하나의 공통된 기도에서 발생하고 전신 면역반응을 유도하는 염증 질환임을 시사하는 것이다. 이를 인체에도 적용한다면 병균이 침입하여 상기도에서만 알레르기 및 염증이 있을 때 전신의 특이항체 형성 등의 면역반응은 하기도까지 염증이 있을 때보다 심할 수도 있다. 따라서 알레르기 비염 환자에서도 하기도 기도과민성 유무를 검사하고 전신 면역상태를 판단하는 여러 지표들을 통해 포괄적인 진단 및 치료가 필요할 것이다.

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