교신저자：전경명, 602-739 부산광역시 서구 아미동 1가 10  부산대학교 의학전문대학원 이비인후과학교실
교신저자：전화：(051) 240-7330 · 전송：(051) 246-8668 · E-mail：Chonkm@pusan.ac.kr

서     론

   중이염은 이비인후과나 소아과를 찾아오는 환자 중에서 상기도염 다음으로 높은 빈도를 차지하는 질환이다.¹⁾ 또한 만성 삼출성 중이염으로 인한 난청은 언어발달과 습득에 장애를 초래할 수 있기 때문에 치료가 중요하다. 다양한 방법으로 치료가 행해지고 있으나 근본적인 치료가 어려운 이유는 발병 원인이 다양하기 때문이다.²⁾ 현재까지 밝혀진 바에 따르면 바이러스나 세균 감염, 이관의 기능부전, 알레르기 그리고 환경적·유전적 요소가 상호 복합적으로 작용해 중이염이 발병하기 때문이라고 생각한다.
   이를 포괄적으로 요약하면 여러 감염체와 개체의 방어기전의 상호작용으로 인하여 중이염이 발병하는 것이다.¹⁾
이러한 여러 감염체 중 세균과 바이러스 감염에 대해서는 많은 연구가 이루어져 왔다. 이 중 세균 감염의 흔한 균으로 Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis 등이 있다.
   일반 세균 배양을 통한 양성률은 20~40% 정도이나 최근에는 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 이용해 세균검출을 많이 하고 있으며, 60~90%의 높은 양성률을 보인다.^3,4,5,6)
   최근 Kim 등은 미국의 재발성 급성 중이염, 삼출성 중이염 환자의 삼출액에서 PCR로 진균을 검출함으로써 중이염의 원인균으로 진균의 가능성을 제시한 바가 있다.⁷⁾
   본 연구에서는 우리나라 삼출성 중이염 소아의 중이 내 삼출액에서 PCR을 이용하여 세균 및 진균을 검출함으로써 삼출성 중이염의 병원균을 알아내고, 세균 및 진균이 검출된 환아의 임상양상들과 비교하여 그 의의를 찾고자 하였다.

대상 및 방법

대  상
   2006년 5월부터 2007년 3월까지 본원 이비인후과에 내원한 환아 중 만성 삼출성 중이염으로 진단되어 3개월 이상 관찰하였으나 중이염이 지속되었던 환아 16명(20귀)과 구개열 수술과 중이 내 환기관 유치술을 같이 시행 받은 환아 7명(10귀), 총 23명(30귀)을 대상으로 하였다. 연령은 5개월에서 9세까지로 평균 3.5세였고, 남아와 여아는 각각 17명(20귀), 6명(10귀)이었다. 이 환아 중 아데노이드 비대증이 동반되어 아데노이드 절제술을 같이 시행 받은 경우와 이전에 환기관 삽입술을 받고 다시 재발하여 재수술을 받은 경우도 포함되었다.

검체 채취방법
   외이도에 있는 귀지를 제거하고 70% 에칠 알코올을 사용하여 약 1분간 소독하였다. 이후 고막 절개술을 시행하고 Juhn Tym-Tap Middle Ear Fluid Aspirator/Collector^® (Medtronic/Xomed, Jacksonville, FL)를 사용하여 중이 내 저류액을 채취하였다. 채집된 저류액은 -70℃ 냉동고에 보관하였다.

DNA 추출
   1.5 mL 튜브에 보관된 저류액은 증류수를 500 μL 정도 넣은 후 잘 섞어주고, 13,000 rpm으로 20분 동안 원심분리를 시행하였다. 이후 상층액을 버리고(supernatant) 침전물만을 회수하였다. 침전물을 1.5 mL 튜브에 DNA extraction kit{Instagene-matrix(Bio-Rad, Hercules, CA)}를 100 μL 분주하였다. 
   Vortex 후 56℃, 30분 heat block 정치하였으며, 중간에는 1회 정도 vortex를 하였다. 다음 단계로 10초 동안 vortex 후 100℃에서 8분간 heat block에 정치하였으며, 다시 10초 vortex 후 12,000 rpm으로 3분 동안 원심 분리하였다. 상층액을 1.5 mL 튜브로 옮겨, 사용 전까지 -20℃에 냉동 보관하였다.

중합효소연쇄반응(Polymerase chain reaction, PCR)
   본 연구의 분석을 위한 세균 증폭용 PCR primer는 16S-27F와 16S-518R을 사용하였고, 진균 증폭용 PCR primer는 ITSF3와 ITSR4를 사용하였다(Table 1).⁸⁾
   반응 조성은 100 mM KCl, 20 mM Tris HCl(pH 9.0), 1% Triton X-100, 10 mM deoxynucleoside triphosphates(dATP, dGTP, dTTP, dCTP), 1.5 mM MgCl2, 1쌍의 primer(각각 10 pmole), 1 U Taq polymerase(QIAGEN, Inc., Valencia, CA)로 구성되었고, 주형 DNA 4 μL와 함께 혼합액이 총 50 μL가 되게 하였다. 혼합액을 94℃에서 3분간 변성 후, 94℃에서 1분, 50℃에서 1분, 72℃에서 1분씩 35회 반복하였고, 72℃에서 10분간 연장하였다. 그리고 2차 PCR을 수행하기 위해 첫 번째 PCR 생산물을 이용하여 동일한 반응조성과 반응조건으로 4 μL의 첫 번째 PCR 생산물을 첨가하여 PCR을 수행하였다.

염기서열분석(Sequencing)
   각각의 증폭산물은 2% agarose gel에서 100 V로 25분간 전기영동한 후, UV 투과조명기{UV transilluminator (Bio-Rad, Hercules, CA)}에서 증폭된 결과를 확인하였다. 증폭된 산물은 QIAquick PCR purification kit(QIAGEN, Inc., Valencia, CA)를 이용하여 제공된 방법으로 정제하였다. 정제된 산물은 ABI Prism BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit(Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA)를 이용한 염기서열분석에 사용하였다. 이 염기서열을 바탕으로 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool) 프로그램을 통해 균을 동정하였다.

통계방법
   Fisher's Exact Test를 이용하여 유의수준을 95%로 하였다.

결     과

   삼출성 중이염 환아 23예(30귀)의 중이 내 저류액에 대해 PCR을 시행한 세균에 대한 결과는 총 30귀 중 20귀(66.6%)에서 양성률을 보였으며, 진균은 총 30귀 중 13귀(43.3%)에서 양성률을 보였다.
   또한 30귀에서 세균만 양성으로 나온 경우는 10귀(33.3%), 세균과 진균이 동시에 검출된 것은 10귀(33.3%), 진균만 검출된 것은 3귀(10.0%)였으며, 세균 및 진균 모두 검출되지 않은 것은 7귀(23.3%)였다(Table 2).
   진균의 PCR과정은 ITS(internal transcribed spacer)에 특이적인 universal fungal primer를 사용하여 시행한 전기영동결과 30검체 중 13검체에서 300~400염기쌍(base pairs)에 해당하는 DNA band를 확인할 수 있었다(Fig. 1).
   PCR로 검출된 세균의 종류는 H. influenzae가 13귀(65. 0%), S. pneumoniae 6귀(30.8%)로 대부분을 차지하였다(Table 3). 진균이 검출된 13귀에서 동정된 균은 Candida albicans가 4귀(30.8%)로 가장 많았으며, 다음으로는 Aspergillus niger가 2귀(15.4%), Paecilomyces lilacinus가 2귀(15.4%)였다. 그 외 Basidiomycete yeast, Saccharomycete species, Eurotium rubrum, Dothioraceae species, Stemphylium solani가 각각 1귀에서 동정되었다(Table 4).
   진균에 대한 PCR에 양성을 보인 13검체를 ABI Prism BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit(Applied Biosystems, Foster City, CA)를 이용하여 염기서열분석을 하였고(Fig. 2A), 이 염기서열을 바탕으로 BLAST 프로그램을 통해 균을 동정하여 위와 같은 결과를 얻었다(Fig. 2B and C).
   총 23예 중에서 양측이 모두 삼출성 중이염이 있었던 경우는 7예였고, 이 중 양측이 모두 세균이 검출된 경우는 3예였다. 이 중 각각 1예에서 H. influenzae, S. pneumoniae로 같은 균이 검출되었고, 1예에서는 S. pneumoniae와 H. influenzae가 검출되었다. 진균의 경우 양측이 동일한 진균 종류가 나온 경우는 없었으며, 양측이 모두 진균이 나온 경우는 3예였다.
   세균 및 진균의 PCR에 양성을 보인 검체를 대상으로 임상양상과 비교하였다. 총 23예(30귀) 중 중이 내 환기관 유치술과 함께 아데노이드 절제술을 받은 경우는 6예(7귀)로 이 중 5귀는 PCR에서 세균이 검출되어 71.2%의 양성률을, 아데노이드 절제술을 받지 않은 경우는 17예(23귀) 중 15귀가 세균이 검출되어 62.2%의 양성률을 보여 두 군간의 통계학적 의의는 없었다(p=1.0). 진균의 검출 경우에서도 아데노이드 절제술을 받은 경우 6예(7귀) 중 4귀로 57.1%의 양성률을, 아데노이드 절제술을 받지 않은 경우 17예(23귀) 중 9귀가 검출되어 39.1%의 양성률을 보여 두 군 간에는 통계학적 의의는 없었다(p=0.6656)(Table 5).
   총 23예(30귀) 중 구개열이 동반되어 구개열 수술을 같이 받은 경우는 7예(10귀)로 이 중 6귀는 PCR에서 세균이 검출되어 60%의 양성률을, 구개열을 동반하지 않은 경우는 16예(20귀) 중 14귀가 세균이 검출되어 70%의 양성률을 보여 두 군간의 통계학적 의의는 없었다(p=0.6904). 그러나 진균의 경우에서는 구개열 수술을 같이 받은 7예(10귀) 중 8귀는 PCR에서 진균이 검출되어 80%의 양성률을, 구개열을 동반하지 않은 경우는 16예(20귀) 중 5귀가 진균이 검출되어 25%의 양성률을 보여 두 군간에 통계학적으로 의미 있는 차이를 보였다(p=0.0069)(Table 6).
   총 23예(30귀) 중 재발한 경우는 6예(7귀)로 이 중 6귀에서 세균이 검출되어 85.7%의 양성률을, 재발하지 않은 경우는 17예(23귀)로 이 중 14귀가 세균이 검출되어 60.9%의 양성률을 보여 두 군간에 통계학적 의의는 없었다(p=0.3717). 그러나 진균에서는 재발한 6예(7귀) 중 6귀에서 85.7%의 양성률을 보였고, 재발하지 않은 경우 17예(23귀) 중 7귀에서 30.4%의 양성률을 보여 두 군간에 통계학적으로 의미있는 차이를 보였다(p=0.0247)(Table 7).

고     찰

   Post 등은 삼출성 중이염의 저류액 97검체를 대상으로 세균배양 및 PCR을 시행하여 세균배양검사에서는 28.9%의 양성률을, PCR에서는 77.3% 양성률을 보고하여 PCR을 통한 것이 세균배양에 비해 높은 검출률을 보여주었다.³⁾ Gok 등도 세균배양검사에서 37검체 중 24.3% 양성률, PCR에서 94.5%의 양성률을 보고하였으며,⁴⁾ Pereira 등은 128검체의 세균배양검사에서 19.6%의 양성률, PCR에서 57.0%의 양성률을 보고하였다.⁵⁾ 위 보고들과 같이 중이 삼출액의 세균 검출은 배양검사보다 PCR에서 높은 검출률을 나타내고 있다. 진균에 있어서도 Kim 등은 중이 내 삼출액에서 진균배양검사상으로 검출되지 않았으나, PCR을 통해 34%의 양성률을 보고하여 PCR이 높은 검출률을 나타내었다.⁷⁾ 이러하듯 PCR은 중이 내 삼출액과 같이 소량 검체를 대상으로 원인균을 찾아내는데 민감도와 특이도가 높은 검사이다.
   PCR은 목적으로 하는 DNA를 2종의 primer와 내열성의 DNA polymerase를 사용하여 시험관 내에서 DNA 합성반응을 반복함으로써 목적으로 하는 DNA 단편을 수십만 배 증폭시키는 반응으로 미정제된 DNA나 부분 정제된 DNA로부터 목적의 염기배열을 증폭시킬 수 있다는 특징을 가지고 있다. 한편 PCR 양성인 경우에서 이것이 살아있는 세균의 존재를 뜻하는 것인지 아니면 감염은 없어진 상태에서 단지 DNA만 존재하는 것인지에 대해 의문이 제기될 수 있다. Post 등은 chinchilla 모델에서 열처리된 세균(heat-killed bacteria) 또는 정제된 DNA(purified DNA)를 접종한 경우에 3일 이후에 중이 내 삼출액에서 DNA가 검출되지 않았으나, 살아 있는 균을 접종하고 3일 이후부터 항생제 치료를 시작한 경우에 있어서는 세균배양검사에서 음성의 결과를 보이나 21일 이후에도 PCR을 통해 세균의 DNA가 검출되었다고 보고하였다.³⁾ 정제된 DNA(purified DNA) 또는 열처리된 세균의 DNA(heat-killed bacteria)는 중이 내에 존재하지 않으며, 항생제가 처리된 균일지라도 생존해 있는 경우는 중이 내에 존재함으로써 PCR을 이용한 DNA 검출은 살아있는 균을 증명함을 보여주었다.^9,10) 또한 Rayner 등은 배양검사에서는 음성을 보이는 삼출성 중이염에서 DNA의 검출이 살아있는 세균을 의미하는 것인지 아니면 화석처럼 된 잔재물의 의미인지 알아보기 위해, 삼출액에서 H. influenzae의 mRNA를 RT-PCR을 통해서 검출하였다. mRNA(bacterial messenger RNA)는 반감기가 약 수 초에서 수 분정도로 mRNA의 검출은 살아있으며, 활동적인 대사활동을 하는 세균이 있음을 의미한다.¹¹⁾
   과거에는 살아있는 세균만이 세균배양이 될 수 있다고 생각하고, 배양되지 않는 경우는 살아있는 병원균이 아니라고 생각해 왔다. 그러나 느린 성장의 세균, 배양조건이 까다로운 세균, 생존해 있으나 휴지 상태 등으로 배양될 수 없는 경우, 균막(biofilm)에 있는 세균 등의 경우에서는 살아있는 세균이라도 쉽게 배양되지 않는다.¹²⁾ Post 등은 살아있는 병원균이 실제 존재함에도 많은 삼출성 중이염에서 세균 배양검사상 음성이 나오는 것은 균막(biofilm)을 형성하기 때문이라고 제시하였고, 또한 고막 절개 및 통기관 삽입술 전에 다양한 항생제의 사용으로 병원균의 증식이 현격히 감소하기 때문이라고 제시하였다.^3,11) 또한 Ehrlich 등은 이러한 이유를 삼출액 내에서의 내독소(endotoxin) 때문이라고 제시하였다.¹³⁾ 
   삼출성 중이염에서 진균의 병원균으로서의 역할에 대한 연구는 미비하다. 그러나 최근 Kim 등은 재발성 급성 중이염, 삼출성 중이염의 삼출액에서 배양검사 결과 어떠한 균도 동정되지 않았지만, PCR을 통하여 진균 DNA를 29검체 중 10검체(34%)에서 검출하였으며, 염기서열분석을 통해 동정된 진균은 C. albicans, Malassezia furfur였다.⁷⁾ 이러한 삼출액 내에서 진균의 DNA 검출은 병원균의 가능성을 제시할 수 있다. 또한 본 연구에서는 이전 연구에 비해 PCR을 통한 진균 양성률이 43.3%로 더 높은 검출률을 보여주고 있으며, PCR에 양성을 나타내는 13검체에 있어서 8종류의 진균을 동정할 수 있었다.
   본 연구에서 동정된 8종류의 진균 중 가장 많이 검출된 C. albicans는 피부와 소화기 계통의 정상세균총의 하나로, 표재성 감염부터 범발성 감염까지 감염 형태가 매우 다양하여 외이도 진균증의 흔한 원인균으로 알려져 있다.¹⁴⁾ A. niger는 침습성 폐 아스페르길루스증의 주요 원인이며, A. fumigatus와 함께 진균구(fungus ball)를 잘 형성하는 것으로 알려져 있다.¹⁵⁾ 이외에도 외이도 진균증과 진균성 부비동염의 원인으로 알려져 있다.¹⁵⁾ Paecilomyces lilacinus는 주로 면역이 저하된 사람에서 안구 진균증, 심내막염을 일으키며, 일부에서는 부비동염의 원인균으로 알려져 있다.¹⁵⁾ Basidiomycete yeast는 일부에서 인간에 병원균으로 작용하고, Sccharomycete sp.는 인후, 소화기 계통에 정상 또는 일과성 균으로 이물질을 삽입한 경우에 감염을 종종 일으키는 것으로 보고되어 있다.¹⁵⁾ Eurotium rubrum, Dothioraceae sp., Stemphylium solani는 주로 식물병 등을 일으키며 인간에서는 임상적 의의를 거의 가지지 않는 균종이다.¹⁵⁾
   최근 부비동염에 있어서 진균의 병원균으로서의 역할에 대해 PCR을 이용한 많은 연구가 이루어지고 있다.¹⁶⁾ 실제 부비동 공간과 중이 내 공간은 기능적, 해부학적으로 유사점을 가지고 있다. 공기로 채워진 공간이며, 점막의 점액섬모운동이 정상적인 공간을 유지하는데 중요한 역할을 한다는 것이다. 또한 중이와 부비동의 분비물에는 세균학적으로 세균총의 유사점이 있다. Brook 등은 삼출성 중이염과 만성 부비동염을 같이 가지고 있는 환아를 대상으로 세균학적 배양검사를 시행하여 양성으로 나온 환자 중 69%에서 세균학적 일치를 보고한 바 있다.¹⁷⁾ 높은 점액분비를 가지는 삼출성 중이염의 중이환경은 진균의 포자를 잘 포획할 수 있는 환경으로 진균의 집락 형성을 더 촉진시킬 수 있을 것으로 생각된다.
   임상적 인자와 관련성에 있어서는 재발한 경우에서 진균의 검출률이 높게 조사되었다. Martin 등은 외이도염(71.7%)과 중이 내 환기관 설치 후의 지속되는 이루 환자(24.7%)에 있어서 배양검사 결과 진균이 동정된 환자들이 이전에 다양한 전신적 및 국소적 항생제 치료를 받은 병력이 있음을 말했다.¹⁸⁾ 또한 이러한 환자의 기록을 검토한 결과 동반된 질환 중 구개열의 빈도가 가장 높았고, 가장 흔히 동정된 균은 C. albicans였으며, C. parapsilosis, A. fumigatus, A. niger 순으로 동정되었다.¹⁸⁾ 재발한 경우에 있어서 이전의 항생제 사용의 빈도 증가는 진균감염의 빈도를 높일 수 있음을 제시하였다. 또한 중이 내 세균배양검사 결과 진균이 동정된 환자에서 대개 국소용 항진균제(topical clotrimazole, topical fluconazole etc.)를 사용하여 임상적 호전을 경험하였던 것으로 보고함으로써 진균이 병원균으로서의 역할을 했음을 임상적으로 증명하고 있다.^18,19) 본 연구에 있어서 삼출성 중이염에서 진균의 병원균 역할에 대해 제시하기 위해서는 진균에 대한 임상적 치료시도와 이에 대한 호전양상에 대한 경과관찰 등의 연구가 더 필요할 것으로 생각된다.
   다른 임상적 인자로 구개열을 가진 환아에서 진균의 검출률이 높게 조사되었다. 먼저 구개열 환자에서 중이질환이 나타나는 이유는 비강과 구강사이에 있는 구개의 부분 손실로 잦은 감염이 있을 수 있고, 연구개 근육의 비정상적인 기능으로 인한 기능적인 이관의 폐쇄, 수술 후 반흔, 구개저의 해부학적 결함 등을 들 수 있으나, 이 중에서 이관의 기능적 폐쇄가 가장 중요한 원인으로 보고 있다.²⁰⁾ 구개열 환아에서 구개 범장근(tensor veli palatini m.)과 구개 범거근(levator veli palatini m.)의 발육부전과 비정상적인 부착이 이관의 기능적 폐쇄에 중요한 이유가 된다.²¹⁾ 이관의 기능적 폐쇄와 진균의 감염 등에 관한 연구는 아직 미비하다. 하지만 이관의 폐쇄에 따른 중이점막의 변화가 진균의 집락형성(colonization)을 가속화시킬 것으로 생각된다. Vennewald 등은 부비동염 환자에서 부비동의 진균의 집락형성에 대해 발표한 바 있으며, 이러한 집락형성은 만성적인 비대성 부비동염 및 섬모운동을 방해하는 증가된 점액 환경과 밀접한 관련이 있다고 하였다.²²⁾ 하지만 집락화에서 진균 감염의 진행에 대해서는 더 많은 연구가 필요할 것으로 생각된다.
   본 연구 결과는 삼출성 중이염에서 PCR을 통해 진균 DNA가 존재함을 증명하였다. 실제 진균이 병원균의 역할을 함을 제시하기 위해서는 진균에 대한 적절한 치료와 이에 따른 경과관찰에 대한 고찰이 필요할 것으로 사료된다. 또한 본 연구에서는 중이라는 공간의 한계 때문에 정상대조군의 설정을 하지 못했으며, 중이 내의 진균의 존재가 진균의 집락형성인지 진균증(mycosis)인지에 대해서 제시하지 못하였다. 이에 대해서도 정상대조군의 설정으로 비교연구가 필요할 것으로 사료된다.

요     약

   세균 및 진균배양검사는 음성의 빈도가 매우 높아 삼출성 중이염의 세균 및 진균 감염과 병인론을 밝히는데 보다 민감성과 특이성이 높은 검사 방법이 필요하게 되었다. 본 연구에서는 PCR을 통해 세균 및 진균 감염을 알아보고자 하였다. 따라서 삼출성 중이염으로 환기관 삽입술을 시행받은 환아 23명(30귀)에서 고막절개술 후 Juhn's tube를 사용하여 중이 삼출액을 얻은 후 이를 PCR을 통해 세균 및 진균 감염의 여부를 확인하였다.
   총 30귀 중 20귀(66.6%)에서 세균에 대한 양성률을 보였으며, 진균에 대해서는 총 30귀 중 13귀(43.3%)에서 양성률을 보였다. PCR로 검출된 세균은 20귀에서 H. influenzae가 13귀, S. pneumoniae 6귀에서 동정되었다. 진균에 대한 동정 결과는 C. albicans가 4귀(30.8%)로 가장 많이 검출되었으며, 다음으로는 A. niger가 2귀(15.4%), Paecilomyces lilacinus가 2귀(15.4%)에서 동정되었다. 그 외 Basidiomycete yeast, Saccharomycete sp., Eurotium rubrum, Dothioraceae sp., Stemphylium solani가 각각 1귀에서 동정되었다.
   구개열 동반, 재발, 아데노이드 절제술 시행여부와 같은 임상인자와 관련성에 있어서는 세균의 검출률에는 차이가 없었다. 그러나 진균에서는 구개열을 동반한 경우와 재발한 경우에서 통계학적으로 유의한 높은 검출을 보였다.
   이상에서 PCR은 삼출성 중이염의 삼출액에서 원인균을 찾는데 매우 유용한 검사로 생각되며, 본 연구 결과는 세균뿐만 아니라 진균 감염 또한 삼출성 중이염의 병인에 중요한 역할을 할 수 있음을 제시하였다. 삼출성 중이염에서 병인으로서의 진균의 역할 제시에는 보다 많은 연구가 필요할 것으로 사료된다.

1. Inglis AF, Gates GA. Acute otitis media and otitis media with effusion. In: Cummings CW, Flint PW, Harker LA, Haughey BH, Richardson MA, Robbins KT, Schuller DE, Thomas JR, editors. Otolaryngology-Head Neck Surgery. 4^th ed. Philadelphia: Mosby;2005. p.4445-68.

2. Klausen O, Moller P, Holmefjord A, Reisaeter S, Asbjornsen A. Lasting effects of otitis media with effusion on language skills and listening performance. Acta Otolaryngol 2000;543:73-6.

3. Post JC, Preston RA, Aul JJ, Larkins-Pettigrew M, Rydquist-White J, Anderson KW, et al. Molecular analysis of bacterial pathogens in otitis media with effusion. JAMA 1995;273(20):1598-604.

4. Gok U, Bulut Y, Keles E, Yalcin S, Doymaz MZ. Bacteriological and PCR analysis of clinical material aspirated from otitis media with effusions. Int J Pediatr Otorhinolaryngol 2001;60(1):49-54.

5. Pereira MB, Pereira MR, Cantarelli V, Costa SS. Prevalence of bacteria in children with otitis media with effusion. J Pediatr 2004;80(1):41-8.

6. Hendolin P, Markkanen A, Ylikoski J, Wahlfors JJ. Use of multiplex PCR for simultaneous detection of four bacterial species in middle ear effusion. J Clin Microbiol 1997;35(11):2854-8.

7. Kim EJ, Catten MD, Lalwani AK. Detection of fungal DNA in effusion associated with acute and serous otitis media. Laryngoscope 2002;112(11):2037-41.

8. Chen YC, Eisner JD, Kattar MM, Rassoulian-Barrett SL, LaFe K, Yarfitz SL, et al. Identification of medically important yeasts using PCR-based detection of DNA sequence polymorphisms in the internal transcribed spacer 2 region of the rRNA genes. J Clin Microbiol 2000;38(6):2302-10.

9. Post JC, Aul JJ, White GJ, Wadowsky RM, Zavoral T, Tabari R, et al. PCR-based detection of bacterial DNA after antimicrobial treatment is indicative of persistent, viable bacteria in the chinchilla model of otitis media. Am J Otolaryngol 1996;17(2):106-11.

10. Aul JJ, Anderson KW, Wadowsky RM, Doyle WJ, Kingsley LA, Post JC, et al. Comparative evaluation of culture and PCR for the detection and determination of persistence of bacterial strains and DNAs in the Chinchilla laniger model of otitis media. Ann Otol Rhinol Laryngol 1998;107(6):508-13.

11. Rayner MG, Zhang Y, Gorry MC, Chen Y, Post JC, Ehrlich GD. Evidence of bacterial metabolic activity in culture-negative otitis media with effusion. JAMA 1998;279(4):296-9.

12. Post JC. Direct evidence of bacterial biofilms in otitis media. Laryngoscope 2001;111(12):2083-94.

13. Dingman JR, Rayner MG, Mishra S, Zhang Y, Ehrlich MD, Post JC, et al. Correlation between presence of viable bacteria and presence of endotoxin in middle-ear effusions. J Clin Microbiol 1998;36(11):3417-9.

14. Hazen KC, Howell SA. Candida, cryptococcus, and other yeasts of medical importance. In: Murray PR, Baron EJ, Landry ML, Jorgensen JH, Pfaller MA, editors. Manual of clinical microbiology. 9^th ed. Washington, DC: ASM press;2007. p.1802-38.

15. Verweij PE, Brandt ME. Aspergillus, fusarium, and other opportunistic moniliaceous fungi. In: Murray PR, Baron EJ, Landry ML, Jorgensen JH, Pfaller MA, editors. Manual of clinical microbiology. 9^th ed. Washington, DC: ASM press;2007. p.1762-88.

16. Rao AK, Mathers PH, Ramadan HH. Detection of fungi in the sinus mucosa using polymerase chain reaction. Otolaryngol Head Neck Surg 2006;134(4):581-5. 

17. Brook I, Yocum P, Shah K. Aerobic and anaerobic bacteriology of concurrent chronic otitis media with effusion and chronic sinusitis in children. Arch Otolaryngol Head Neck Surg 2000;126(2):174-6. 

18. Martin TJ, Kerschner JE, Flanary VA. Fungal causes of otitis externa and tympanostomy tube otorrhea. Int J Pediatr Otorhinolaryngol 2005;69(11):1503-8.

19. Vennewald I, Schönlebe J, Klemm E. Mycological and histological investigations in humans with middle ear infections. Mycoses 2003;46(1-2):12-8.

20. Lee HK, Koh KM, Kim KR, Park CW, Ahn KS, Uhm KI. Evaluation of otitis media with effusion in cleft palate patients. Korean J Otolaryngol 1995;38(2):230-5.

21. Matsune S, Sando I, Takahashi H. Insertion of the tensor veli palatini muscle into the eustachian tube cartilage in cleft palate case. Ann Otol Rhinol Laryngol 1991;100(6):439-46.

22. Vennewald I, Henker M, Klemm E, Seebacher C. Fungal colonization of the paranasal sinuses. Mycoses 1999;42 Suppl 2:33-6.