Address for correspondence : Yong-Bum Cho, MD, Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, Chonnam National University Medical School, 8 Hak-dong, Dong-gu, Gwangju 501-190, Korea
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서     론

   내이의 수분 환경은 청각 및 평형 유지 등 내이의 기능 유지에 중요하고, 내림프와 외림프로 나뉜다. 이 중 내림프는 세포내액과 그 성분이 비슷하고 외림프액에 비해 고장성이며, 80 mV의 전압을 유지하고 있어 와우 및 전정기관의 정상적인 신호전달에 필수적이다. 평형유지 기관인 전정기 및 청각을 담당하는 와우 코르티 기관(organ of Corti) 등은 이러한 내림프로 채워졌으며 내림프의 항상성이 유지되지 못한 상황은 내림프수종(endolymphatic hydrops)으로 나타나는 메니에르병과 같은 질환 등을 초래할 수 있다.¹⁾
   그간 내림프 조절에 관한 연구는 주로 내림프 공간에서 전해질 이동 등에 한정되었으나 막의 수분 통로 단백(aquaporin, AQP)이 발견된 후 내림프에서도 수분 이동 및 조절에 관심이 증가되고 있다. 특히, AQP 수분 통로 가운데 AQP2는 신장의 집뇨세관에 존재하면서 항이뇨 호르몬(arginine vasopressin, AVP)의 조절하에 수분 재흡수를 담당하고, 체액량 감소에 반응하여 수분 항상성을 유지한다. 
   내이와 신장은 그 미세구조 및 기능면에서 흡사한 면이 많아 내이의 수분 조절에도 AQP2가 밀접히 관련되어 있을 것으로 추정되며, 여러 연구에서 내림프의 주 조절기관인 내림프낭(endolymphatic sac)에서 AQP2가 발현됨이 보고되었고, 이러한 AQP2가 AVP 주입에 의하여 발현이 조절됨이 알려져 내이의 내림프 조절에도 AVP-AQP2 시스템이 관여하고 있을 것으로 추정된다.^2,3,4,5,6) 
   체액량 감소 시 신장에서 AVP-AQP2 시스템이 활성화되어 수분 재흡수가 증가하는 것처럼 체액량이 감소하면 내이에서도 항상성을 유지하기 위해 AVP-AQP2의 기능에 변화가 있을 것으로 생각되며, 최근 메니에르병과 같은 내림프 수종에서 수분 제한보다 충분한 수분 공급이 증상 조절에 더 유리하다고 알려지면서 이러한 AVP-AQP2 시스템이 내림프수종의 한 병인임을 짐작할 수 있다.^1,7) 따라서 본 연구에서는 수분 제한이 분자생물학적으로 내이 AQP의 발현에 어떠한 변화를 초래하는지 알아보고자 하였다. 

재료 및 방법

실험 재료 및 요 및 혈중 AVP 농도의 측정
   실험 재료는 무게 250 g 가량 되는 Preyer reflex 양성을 보이는 건강한 수컷 기니픽 24마리를 사용하였다. 실험의 전체 과정은 본 대학 실험동물 사용 윤리지침을 준수하였다. 실험군에서 3일간 수분 공급을 끊었으며, 대조군은 물 부하를 위해 sucrose 600 mM 용액을 같은 기간 섭취하게 하였다. 모든 동물은 metabolic cage에 두었고 24시간 소변을 얻어 삼투농도 및 요량을 측정하였다. 4일째 되는 날 마취하지 않은 상태에서 단두하여 혈액을 채취하고 AVP 농도를 측정하였다. 

와우 전위도 
   내림프 수종의 발생여부를 간접적으로 측정하기 위하여 실험군 및 대조군에서 각각 수분 제한 및 수분 부하 이전과 이후에 와우전위도를 측정하였다. 동물을 sodium pentobarbital(10 mg/kg, 복강 내 투여)로 마취시킨 상태에서 이개후부에 피부절개를 가한 뒤 외이도 후벽의 상단부로부터 bulla를 노출시키고 drill로 개방시켰다. 와우기저회전의 말단부(hook region)에 있는 정원창을 확인하고 0.2 mm 직경의 활성 전극을 위치시킨 뒤, 기준전극은 이개부에 그리고 접지전극을 경부근육에 부착하였다. 직장 내 온도를 35℃로 유지하도록 온열포를 사용하였다. 와우전위도를 측정하기 위하여 Navigator SE evoked potential system(Bio-logic Systems Corp., Mundelein, IL, USA)를 사용하였고 자극음은 alternative click을 사용하여 초당 7.5회의 반복률로 총 1,000회의 음자극을 주었다. 500 Hz에서 8,000 Hz까지의 주파수에 따른 첫번째 negative peak의 전위역치를 action potential(AP)로, 그 이전에 AP에 접하여 꺾인 곡선 부위를 summation potential(SP)로 하여 SP/AP 비를 계산하였다. 

면역조직화학 염색
   마취된 동물에 개흉술을 시행한 뒤 좌심실로 먼저 physiologic buffered saline(PBS)을 관류시킨 다음 3% paraformaldehyde 500 mL로 관류를 시행하였다. 측두골을 뇌수막이 붙어 있도록 미세박리하여 획득한 뒤 3% paraformaldehyde에 1일간 담궈 두었다. 그 다음 24시간 동안 0.2 M EDTA solution(Calci-clear rapid^®, National Diagnostics, USA)으로 탈회시켰다. Paraffin block을 만들어 5 μm 두께로 와우축에 평행하게 절편을 얻어 전처리된 슬라이드 유리(ProbeOn^TMPlus, Fisher Scientific, USA)에 고정시켰다. 탈파라핀화 후 재수화시킨 뒤 3% hydrogen peroxide-60% methanol 용액으로 endogenous peroxidase 활성을 억제하였다. 1시간 동안 5% normal goat serum이 섞인 PBS에 1시간 유지한 뒤 AQP2(Alomone Lab; Jerusalem, Israel) 항체용액(1：200)에 12~24시간 반응시켰다. Biotinylated 2차 항체와 avidin-biotin perioxidase complex reagent에 1시간 동안 둔 뒤 peroxidase substrated diaminobenzidine에 6분 동안 반응시키고 광학현미경으로 관찰하였다.

역전사 중합효소 연쇄 반응
   동물을 단두한 뒤 최대한 빠른 시간 안에 측두골을 획득하였고 와우(골성와우 및 막성와우)와 경막에 있는 내림프낭을 미세박리한 뒤 TRIZOL Reagent(GibcoBRL; Grand Island, NY, USA)를 사용하여 총 RNA를 분리하였다. RNA 농도는 260 nm에서 흡광률 판독으로 결정하였다. AQP2 mRNA 발현은 역전사 중합효소 연쇄 반응으로 측정하였다. 역전사를 위해 1 μg의 총 RNA를 역전사 효소(Superscript II RT, Gibco BRL; 200 U), RNasin(10 U), dNTP mix(10 mmol/L), DTT(0.1 μg/μL), MgCl₂(25 mmol/L), oligo(dT)(0.5 μg/μL), 반응 완충제[Tris-HCl(pH 8.4) 200 mmol/L, KCl 500 mmol/L] 등으로 처리하고 최종 부피를 20μL로 만들어 42℃에서 50분간 배양하였다. 72℃에서 5분간의 최종 변성과정을 거쳐 cDNA를 얻어 사용하였다. 중합효소 연쇄 반응을 위해 cDNA 2 μL, primer(sense 및 antisense 각 10 pmol/L), dNTP mix(250 μmol/L), MgCl₂(1.5 mmol/L) 및 Taq polymerase(1 U), 반응 완충제 등을 섞고 최종 부피를 20 μL로 만들어 thermal cycler(M.J. Research; Watertown, MA, USA)에 반응시켰다. AQP2은 95℃에서 1분, 57℃에서 30초, 72℃에서 45초로 32 cycle로 얻었다. 마지막으로 72℃에서 10분 연장한 후 끝냈다. 사용한 AQP2 primer는 sense 5'-AGTGCTGGCTGAGTTCTTGG-3' 및 antisense 5'-GCTGTGGCGTTGTT GTGGAG-3'로써 최종산물은 344 bp 조각이었다. 중합효소 연쇄 반응의 산물은 2% agarose gel 전기 영동법을 이용해 크기별로 분리하였고, ethidium bromide 염색으로 자외선 아래에 보이게 하였다. AQP2의 cDNA는 IMAGER^TM&1D MAIN(Bioneer, Korea)으로 정량하였다.

실시간 중합효소 연쇄 반응 및 정량적 분석
   상기방법으로 합성된 cDNA 2 μL, SYBR premix Ex taq(2x) 10 μL, D/W 7.2 μL, AQP2 primer sense/antisense 0.4 μL/0.4 μL로 된 총량 20 μL 시약으로 RG-3,000(Corbett Research)을 사용하여 검출하였다. SYBR premix Ex Taq(TaKaRa)의 성분은 TAPS(pH 9.3) 25 mM, KCl 50 mM, MgCl₂ 2 mM, 2-mercaptoethanol 1 mM, dATP 200 μM, dGTP 200 μM, dTTP 200μM, [a-³²P]-DcTP 100 μM이었다. 사용한 AQP2 primer는 상기 역전사 중합효소 연쇄 반응과 동일하였으며 95℃에서 30초, 56℃에서 30초, 72℃에서 30초로 40 cycle로 얻었다. 비교 정량 분석을 위한 house keeping gene으로는 GAPDH를 사용하였다. 

단백 분리 및 Western blot 분석 
   와우와 경막에 있는 내림프낭을 미세박리한 뒤 pH 7.6에서 sucrose 250 mmol/L, EDTA 1 mmol/L, phenylmehylsulfonyl fluoride 0.1 mmol/L, Tris-HCl 10 mmol/L, 완충제가 섞인 용액에 넣어 3,000 rpm으로 회전시켜 균질화 하였다. 상층부의 단백 표본을 microplate reader를 이용하여 정량화한 후 12.5% polyacrylamide resolving gel과 12.5% polyacrylamide stacking gel로 구성된 비연속계를 써서 전기 영동법으로 크기에 따라 분리하였다. 얻어진 단백을 다시 전기 영동법으로 3시간 동안 36 V에서 nitrocellulose 막에 전이시켰다. 이 막을 0.1% Tween-20이 포함된 Tris-based saline 완충제(TBST)로 세척하고, 1시간 동안 TBST 내에서 5% 무지방우유로 차폐하였다. 다음 1,000배 희석한 다중클론 토끼 AQP2 항체를 섞어 4℃에서 하루 동안 반응시킨 후 이 막을 horseradish peroxidase-labeled goat anti-rabbit IgG(1：1,200)으로 처리하였다. TBST로 세척 후 ECL plus western blot detection system(GE Healthcare, UK)으로 발색시켜 LAS 3,000(Fujifilm, Japan)을 통해 검색하였다. 

통계 처리 
   실험 결과의 통계 처리는 SPSS 12.0(Chicago, IL, USA)를 이용하여 paired 및 independent sample t-test를 시행하였고, p값이 0.05 미만인 경우 통계학적으로 유의하다고 판정하였다. 

결     과

요 삼투압 및 AVP 농도 
   실험군에서 대조군에 비해 배뇨량이 감소하였으며 요 삼투압은 유의하게 증가되었다. 실험군에서 3일째 요량이 극히 적어 요 삼투압의 측정이 불가능하였다. 혈중 AVP 농도는 대조군에서 0.78±0.3 pg/mL, 실험군에서 9.2±0.8 pg/mL로 후자에서 현저히 증가하였다(Table 1, 2 and 3).

와우 전위도 
   와우 전위도의 SP/AP 비는 실험군에서 평균 0.55였으며 수분조절 이전 값인 0.28에 비해 유의하게 증가한 소견을 보였다. 대조군에서는 평균 0.29로 수분조절 이전과 차이를 보이지 않았다(Fig. 1).

면역조직화학 염색
   내이에서 AQP2의 발현은 주로 혈관조(stria vascularis), 나선인대(spiral ligament), 나선연(spiral limbus)과 내림프낭(endolymphatic sac)에서 나타났다. 또한 약하지만 반고리관의 내피세포에서도 양성을 보였다. 그러나 코르티 기관이나 라이스너 막에서는 관찰되지 않았다. 또한 실험군에서 대조군에 비해 발현이 현저하게 증가되었다. 전체 와우 내에서 AQP2 단백의 발현은 첨부에 비해 기저부에서 더 강하게 발현되었다(Figs. 2 and 3).

AQP2 역전사 중합효소 연쇄 반응 및 실시간 중합효소 연쇄 반응
   AQP2 mRNA의 발현은 역전사 중합효소 연쇄 반응 결과 와우나 내림프낭 모두 실험군에서 대조군에 비해 유의하게 발현이 증가된 양상을 보였다. 이는 실시간 중합효소 연쇄 반응에서도 동일한 결과를 확인할 수 있었다(Figs. 4, 5, 6, 7).

단백질 발현 분석
   Western blotting을 이용한 검사에서 AQP2 단백 역시 와우와 내림프낭에서 모두 실험군이 대조군에 비해 발현이 더 높았다(Figs. 8 and 9). 

고     찰

   AQP은 수분 및 glycerol, urea 같은 작은 용질 등이 세포막을 통과하는 데 고특이성을 가진 막성단백으로 그 투과력은 삼투압적인 혹은 화학적인 구배가 주 구동력으로 알려져 있다. 현재까지 사람에서 11종의 AQP0-AQP10의 존재가 확인되었으며, 각각은 수분 및 용질에 대한 투과력이 서로 다르며 체내 조직내의 분포 및 그 조절방식에서도 차이가 있는 것으로 알려져 있다. 가장 잘 알려진 AQP는 신장의 생리와 관련된 AQP1-AQP4로 소변량 조절에 밀접하게 연관되어 있고, AQP2는 신장의 집뇨세관에 분포되어 있으며 뇌하수체 후엽에서 분비되는 AVP의 영향을 받아 수분의 재흡수에 연관되어 있다. 즉, AVP가 V2 수용체를 자극하면 세포내 cAMP가 증가하며 그 결과 Ser256에서 AQP2 인산화가 이루어지면서 세포내 소포(vesicle)가 선단막(apical plasma membrane)으로 이동하여 수분 투과력이 증가하는 것으로 알려져 있다.⁸⁾ 
   신장에서의 수분 조절에 AQP이 밀접히 관여함이 밝혀지면서 신장 이외에 수분조절이 필요한 안구, 폐, 뇌 및 내이 등에도 이런 AQP이 관여할 것으로 추정되어 내이에서의 AQP 분포 및 그 기능에 대한 연구가 활발한 실정이다. 현재까지 내이에서는 AQP1-7, 9의 8가지 AQP 아형의 존재가 증명되었으며 AQP1은 내이의 여러 부분에서 mRNA 및 단백의 형태로 증명되었는데 골성와우에 근접한 섬유세포, 나선인대(spiral ligament), 기저막하세포 등에서 발견되었다.^2,9,10,11) 그러나 내림프의 생성과 관련된 세포에서는 보이지 않아 내림프나 외림프액의 용적조절에는 관련이 없을 것으로 추정되고 있다. AQP2는 내림프가 접하고 있는 구조물 즉 라이스너막(Reissner's membrane), 코르티 기관(organ of corti), inner and outer sulcus cells, 나선연(spiral limbus) 등에서 발현되었다.^2,4,12,13) 내림프낭의 상피세포에 AQP2가 발현되는 사실은 이 수분 통로가 내림프 양의 조절에 중요한 역할을 할 것을 암시한다.¹⁴⁾
   본 연구에서도 AQP2의 발현은 주로 혈관조, 나선인대, 나선연과 내림프낭에서 나타났다. 또한 약하지만 반고리관의 내피세포에서도 양성을 보였다. 그러나 코르티 기관이나 라이스너 막에서는 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 AQP2가 내림프의 조절과 연관되었다고 알려진 구조물인 혈관조 및 내림프낭 등에서 발현되어 내림프의 용적을 조절하는 수분 통로로서 중요한 역할을 할 것임을 추론하게 한다.
   수분 섭취를 제한한 경우 인체 및 실험동물 등에서 혈장 AVP 농도와 요 중 AQP2가 증가하는 것으로 보고되었다.^15,16) 또한 출혈 등의 급성 혈액 용적 감소시 체액 용적 회복을 위한 보상기전으로 AVP 분비가 증가되면 AQP2를 신장에서 수분 재흡수가 촉진되는 것으로 잘 알려져 있다.¹⁷⁾ 이처럼 체액 용적 감소시 신장에서 AVP-AQP2 시스템이 활성화되는 것으로 알려져 있지만, 내이에서의 AVP-AQP2 시스템의 변화에 대한 연구는 거의 없는 실정이다. 본 연구에서는 수분 섭취를 제한한 군과 수분을 충분히 섭취한 군을 비교하여 내이에서 AQP2 단백의 면역조직화학적 염색상 분포와 중합효소 연쇄 반응을 통한 AQP2 mRNA 및 western blot을 통한 AQP2 단백의 양적인 비교를 통해 수분 섭취 제한시 내이에서 AQP2 단백이 활성화되는지를 확인해보고자 하였다. 본 연구 결과 수분섭취를 제한한 경우 내이 특히 내림프액의 생성 및 흡수와 밀접한 연관이 있는 것으로 알려진 내림프낭 및 혈관조 등에서 AQP2의 발현이 현저히 증가함을 확인할 수 있었다. 이 결과는 수분섭취 제한 등을 비롯한 체액 용적 변화 시 내이에서도 AQP2 단백 전사 등이 활성화됨을 시사한다. 
   메니에르병 환자에서 혈장내 AVP 농도가 높고(Takeda 등, 1995), AVP를 일시적으로 혹은 만성적으로 주입한 경우 기니픽 및 백서에서 내림프 수종이 유발된 연구 결과 등은 AVP 증가가 내림프수종을 초래할 수 있음을 시사하였다.^3,18) 하지만 AVP가 신장에서처럼 AQP2의 발현을 증가시켜 내림프수종을 유발하는 것인지에 대해서는 아직 이견이 남아있는 실정이다. Kumagami 등³⁾은 fluid-phase endocytosis 방법을 통한 연구에서 AVP 투여가 내림프낭 ribosomal-rich cell의 membrane turnover를 억제하고 이것은 AQP2의 이동을 억제하게 되어 결국은 AVP가 AQP2에 미치는 영향은 신장에서와 반대로 억제하는 작용임을 주장한 바 있다. 그러나 AVP 주입 시 AQP2 mRNA 발현이 증가한 결과나 V2 길항제 OPC-31260 투여 시 AQP2 mRNA 발현이 감소하고 내림프수종이 줄어든 결과 등은 내이에서도 AVP가 AQP2를 활성화시킴을 시사하는 것으로 추정된다.^4,5,19) 
   본 연구에서는 수분 제한시 내림프 용적의 변화를 알아보기 위해 간접적인 방법으로 와우 전위도를 측정하였다. 와우 전위도는 내림프수종의 정도를 잘 반영하는 것으로 인정되고 있으며 임상적으로 메니에르병의 객관적 진단방법으로 이용되고 있다. 내림프수종 시 관찰되는 와우 전위도의 변화는 cochlear microphonics 감소와 왜곡, action potential(AP)의 전위역치 증가 및 자극음의 강도에 따른 반응곡선의 변화, summation potential(SP) 또는 SP/AP 비의 증폭 등이 관찰된다고 보고되었다. 특히 click 음자극에 대해 SP/AP 비가 40~50% 이상 증가하는 것이 내림프수종의 존재를 의미하는 것으로 잘 알려져 있다. SP가 증가하는 기전에 대해서는 확실치 않지만 기저막이 고실계(scala tympani)쪽으로 전위되기 때문이라고 여겨지고 있다.²⁰⁾ 본 연구 결과에서도 와우 전위도의 SP/AP 비는 수분섭취를 제한시킨 실험군에서 평균 0.55였으며 수분 조절 이전 값인 0.28에 비해 유의하게 증가한 소견을 보였으며, 수분 부하를 시킨 대조군에서는 평균 0.29로 수분 조절 이전과 차이를 보이지 않았다. 이러한 결과는 수분 섭취를 제한시킨 경우 간접적으로 내림프 용적이 증가하고 내림프수종이 발생할 수 있음을 시사하는 소견으로 사료된다.
   본 연구에서 내이에서 발현된 AQP2 수분 통로가 어떤 기전을 통하여 내림프 용적의 증가를 초래하는지는 명확치 않다. AQP 수분 통로 단백을 통한 수분 이동의 주 구동력은 삼투이며 내림프의 고장성은 수분 이동의 방향을 내림프 공간방향으로의 단방향의 흐름을 만든다. 즉, 비교적 저장성인 공간에서 고장성인 공간으로 수분 이동이 이루어지므로 내림프에 접한 구조물에서 AQP2 단백이 발현되면 주위 외림프에 비해 내림프가 더 고장성이므로 수분 통로 단백을 통한 수분 이동은 외림프강에서 내림프강 방향으로 이루어질 것이라 보인다. 내림프낭에서는 Beitz 등⁸⁾의 수분조절모델에서처럼 주위 모세혈관 등에 비해 내림프낭이 고장성이어서 내림프낭에서 AQP2 발현이 증가하면 결국 내림프낭으로 흐르는 수분의 이동이 이루어질 것이다. 또한 내림프가 생성되는 곳으로 알려진 혈관조에서 AQP2 발현이 증가하면 수분의 투과력이 증가하여 생성되는 내림프의 양이 많아질 것으로 추정된다. 위와 같은 기전을 통해 내이의 여러 부위에서 AQP2 발현이 증가할 때 결과적으로 내림프 용적이 증가하는 방향으로 변화가 이루어질 것이라 생각된다.
   기존의 메니에르병의 치료방법은 삼투성 이뇨제와 함께 염분 및 수분을 제한하였는데 이런 방법이 급성 증상 개선에는 효과가 좋으나 장기간에 걸쳐 볼 때 재발성의 현훈 발작을 보이고 청력이 더 악화되는 경우가 있다. 뿐만 아니라 Naganuma 등⁷⁾은 메니에르병 환자에서 충분한 양의 수분을 섭취하는 것이 장기적으로 메니에르병의 임상증상인 현훈 발작 및 청력면에서 우수하여 고식적인 치료법 이외에도 수분 섭취가 그 치료의 한 방법이 될 수 있다고 발표한 적이 있다. 본 연구 결과는 수분 제한시 내림프 용적이 증가되는 결과를 보였는데 내림프수종이 있는 경우에도 비슷한 실험 결과를 보인다면 메니에르병과 같은 내림프수종의 경우 수분 제한보다는 수분의 충분한 공급이 증상의 조절에 유리할 것임을 시사한다. 
   뇌하수체 후엽에서 AVP는 혈중 삼투압의 증가나 순환 혈액량의 감소 등에 반응하여 분비가 증가하므로 수분을 제한하는 것보다는 수분을 충분히 섭취하는 것이 AVP의 분비를 최소화할 수 있을 것이며, 혈중 AVP 농도가 낮으면 내이의 AQP2의 발현도 억제되어 내림프 용적도 최소화할 수 있을 것으로 사료된다. 그러나 본 실험 모델이 내림프수종이 유발된 동물 모델이 아니기에 직접적으로 본 실험의 결과를 메니에르병에서의 임상적인 의의로 접목시키기는 어려울 것으로 생각되고, 메니에르병과 같은 내림프수종의 상태에서는 수분 제한이 내림프 용적에 어떤 변화를 가져오는가에 대해 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.

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