Address for correspondence : Yoo-Sam Chung, MD, Department of Otolaryngology, Asan Medical Center, University of Ulsan College of Medicine, 388-1 Pungnap 2-dong, Songpa-gu, Seoul 138-736, Korea
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서     론

   Rhinovirus는 감기를 일으키는 바이러스로 알려져 있고 상기도 감염을 주로 일으키나 하기도에도 감염되어 천식을 악화시키기도 하며,¹⁾ rhinovirus에 의한 선행감염으로 인해 급성 세균성 부비동염으로 진행이 되기도 한다.²⁾ Rhinovirus에 감염된 기도상피세포는 다양한 염증매개물질들을 내어 기도염증과 폐색을 일으키거나 강화할 수 있다.¹⁾ Rhinovirus가 천식을 악화시키는 정확한 기전은 아직 알려져 있지 않으나 kinin이나 histamine 등의 염증매개물질을 증가시키고 기도점막과 점막하에 중성구, 임파구, 호산구 등의 염증세포들을 침윤시키며 기도상피세포 등으로 하여금 다양한 interleukin들과 granulocyte macrophage colony-stimulating factor, regulated upon activation, normal T-cell expressed and secreted 등을 생성하게 하고 intracellular adhesion molecule-1의 발현을 증가시킨다.¹⁾ 또한 초기에는 주로 혈장성분의 분비물을 발생시키나 후기에는 점도가 높은 mucus를 생성시켜 기도를 폐쇄할 가능성이 제기되었다.³⁾ 한편, 사람의 코에서 rhinovirus는 초기에는 수양성 비루를 일으키나 후기에는 mucus의 분비를 증가시킨다.⁴⁾
   Mucus는 염증반응이나 환경인자로 인해 과분비될 수 있고⁵⁾ 과분비가 지속되는 경우 천식, 만성폐쇄성폐질환 등을 일으킬 수 있다. Mucin glycoprotein은 기도의 점액에 점도와 탄성을 생기게 하고⁶⁾ 점액의 주된 고분자이기 때문에⁶⁾ 점액유전자의 발현이 증가하고 mucin이 증가하는 것은 점액 과분비와 동반된다고 생각된다. 현재까지 알려진 기도상피에서 발현하는 점액유전자는 MUC1, MUC2, MUC4, MUC5B, MUC5AC, MUC7, MUC8 등이 있다.⁷⁾ 그 중 MUC5AC는 기관지천식과 정상인에서 기도분비물 중 주성분으로⁷⁾ MUC1이나 MUC2보다 비용조직,⁸⁾ 비갑개,⁹⁾ 기관상피세포¹⁰⁾에서 발현이 증가되어 있다.
   A549 세포주는 폐암조직에서 배양한 세포로 mucin 유전자발현과 단백연구에 적합하다.¹¹⁾
   그러나 rhinovirus 감염이 기도상피세포에서 Mucin messenger ribonucleic acid(mRNA) 발현에 미치는 영향에 대해서는 잘 알려지지 않았다. 저자들은 rhinovirus 감염이 기도상피세포에서 Mucin mRNA 발현에 미치는 영향에 대해 연구하고자 하였다.

재료 및 방법

바이러스
   Rhinovirus-16(ATCC, Manassas, VA)은 PBS로 희석하여 -70℃ 냉동고에 실험 시까지 보관하였다. 본 연구를 위해서 주요 군에 속하고 가장 흔하게 실험에 사용되는 serotype으로 rhinovirus-16을 사용하였다.

세포의 배양
   A549 세포(alveolar epithelial type II respiratory cells, ATCC, Rockville, MD)는 10% fetal bovine serum(FBS) (Hyclone Laboratory, Logan, UT)이 포함된 10% Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 Kaighn's Modification(DMEM/F-12K)를 기존 배양액으로 하여 배양하였다. 바이러스 역가의 측정에 사용된 MRC-5 세포(human fetal lung fibroblast, ATCC, Rockville, MD)는 2 mM L-glutamine, 20 mM HEPES, 100 units/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 0.25 μg/mL fungizone을 포함하는 minimum essential media(MEM)(Gibco, Grand Island, NY)를 기본 배양액으로 하여 10% FBS을 첨가하여 95%의 공기, 5% 이산화탄소, 37℃의 항온, 항습 조건에서 배양하였다.

A549 세포에 대한 rhinovirus-16 감염
   실험군은 A549 세포에 배양액만 처리된 대조군, 대조군에 rhinovirus-16을 감염시킨 감염군, 대조군에 inactivated rhinovirus-16을 감염시킨 불활성군의 3개의 군으로 나눴다. 각 실험군에서 A549 세포를 6 well plates에 한 well당 5×105의 수가 되도록 분주하고 10% DMEM/F-12K 배양액 2 mL를 넣고 배양하였다. 대조군은 A549 세포를 10% DMEM/F-12K에서 28시간 동안 배양하였다. 감염군에서는 rhinovirus을 1 MOI(multiplicity of infection)로 4시간 감염 시킨 후 PBS로 세척하여 rhinovirus을 제거하고 24시간 동안 배양하였다. 불활성군에서는 UV로 inactivated시킨 rhinovirus을 1 MOI로 4시간 동안 처치하고 PBS로 세척하여 rhinovirus을 제거하고 24시간 동안 배양하였다. 각 군에서 MUC 5AC, 5B, 6, 7, 8에 대한 reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR)을 시행하였다. 각 군의 실험은 5회 반복하였다.

RNA isolation
   각각의 실험 부유물 200 μL에 Trizol(Life Technologie, Grand Island, NY) 용액 1 mL씩을 첨가하고 15초간 vortex를 한 후 chloroform 200 μL를 첨가하여 충분히 혼합한 후 4℃ 15,000 rpm으로 15분간 원심분리하여 상층에 있는 RNA 부유액을 채취하였다. 얻어낸 부유액을 동량의 isopropanol로 처리한 후 동일조건으로 원심분리하여 RNA 침전물을 얻었고 75% ethanol로 세척한 후 0.1% dicthyl pyrocarbonate 희석 증류수에 용해시켰다. 용해된 RNA의 농도와 순도를 확인하기 위해 spectrophotometer(Molecular Devices, Menlo Park, CA)로 260 nm 및 280 nm에서의 optical density를 측정하였다.

Mucin gene mRNA 검출을 위한 RT-PCR
   총 RNA를 Tri-Reagent(Molecular Research Center, Cincinnati, OH)를 이용하여 추출하였고 MUC5AC mRNA는 RT-PCR 방법을 이용하여 측정하였다. 총 mRNA를 무작위 hexanucleotide primer들과 Moloney murine leukemia virus(MMLV) reverse transcriptase(Perkin Elmer, Morrisville, NC)를 사용하여 cDNA로 역전사하였다. RT-PCR에 사용한 oligonucleotide primer는 Table 1과 같다. PCR은 초기가열 95℃에서 5분 후 MUC5AC의 경우 94℃에서 30초, 60℃에서 1분, 72℃에서 1분간을 30회, MUC5B의 경우 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 30초간을 32회, MUC6는 94℃에서 30초, 60℃에서 60초, 72℃에서 60초간을 30회, MUC7은 94℃에서 30초, 58℃에서 1분, 72℃에서 50초간을 34회, MUC8은 94℃에서 30초, 55℃에서 1분, 72℃에서 1분간을 33회 β-actin은 94℃에서 20초, 60℃에서 50초, 72℃에서 50초간을 32회 시행하고 72℃에서 10분간 시행하였다. PCR 산물은 50 ng/mL의 ethidium bromide가 들어있는 1% Tris-boric acid-ethylenediaminetetraacetic acid 완충용매에서 2% agarose gel을 통한 전기영동을 이용하고 band는 densitometry(Eagle sight software, Stratagene, CA)를 이용하여 분석하였다.

통계처리
   실험결과는 Mann-Whitney U test를 이용하여 유의성을 검증하였다. 통계프로그램은 SPSS 12.0(Chicago, IL, USA)을 사용하였고 p값이 0.05 미만인 경우를 유의한 것으로 정하였다.

결     과

   Rhinovirus 감염 시 A549 cell에서 MUC5AC mRNA 의 발현은 inactivated rhinovirus에 비하여 약 1.85배 가량 증가하였고(p<0.05), MUC7 mRNA의 발현도 inactivated rhinovirus에 비하여 약 2.43배 가량 증가하였으며(p<0.05), MUC8 mRNA는 inactivated rhinovirus에 비하여 약 1.63배 가량 강한 발현을(p<0.05) 보였다. MUC5B, MUC6 mRNA는 발현의 증가가 관찰되지 않았다(Fig. 1).

고     찰

   사람에서 발견된 20가지의 점소 유전자는 막 결합 점소(membrane-bound mucins)인 MUC1, MUC3, MUC4, MUC11, MUC12, MUC17, MUC18, MUC20과 겔 형성 점소(gel-forming mucins)인 MUC2, MUC5AC, MUC5B, MUC6, MUC7, MUC8, MUC9, MUC19가 있다.¹²⁾ 막 결합 점소는 점액의 당질화 부위가 균의 리간드와 결합하여 세균증식, 세포보호, 점막 상피의 세포증식, 종양의 침범, 전이에 관여하고,¹³⁾ 겔 형성 점소는 점막 상피의 표면으로부터 분비되어 점액을 형성하여 상피를 보호하고 감염물질의 침입을 방지한다.¹⁴⁾ 
   본 연구에서는 기도상피세포에서 rhinovirus 처치 후 주요 겔 형성 점소인 MUC5AC, MUC5B, MUC6, MUC7, MUC8의 유전자 발현에 대하여 알아보았다. 불활성군에는 자외선 처리를 한 rhinovirus를 처치하였고 실험군에는 자외선 처리를 하지 않은 rhinovirus를 처치하였다. MUC5AC, MUC7, MUC8 유전자가 대조군에 비하여 실험군에서 약 1.6~2.5배 발현이 증가하였다. RT-PCR은 반 정량적인 검사로 발현이 증가한 것만을 나타낼뿐 정량적인 검사를 위해서는 real-time RT-PCR을 하여야 하나 real-time RT-PCR에 비하여 과정이 비교적 간단하고 검사당 비용이 적어 더 흔하게 사용되고 있다.
   MUC5AC와 MUC5B는 인간기도에서 분비되는 점액의 대부분을 구성하고 있다.^14,15) 그러므로 이번 연구에서 MUC5AC 유전자 발현이 증가한 것은 전체적인 점액분비가 rhinovirus에 의하여 증가할 가능성이 있다는 의미이다. MUC5AC 점액은 사람기관지조직과 사람기관지세포에서 rhinovirus 감염 3시간 후보다 20시간 후에 더욱 증가하였다.¹⁶⁾ 본 연구와 다른 점은 점액유전자가 아닌 배양액 내 점액을 측정하였고 대조군으로 불활성화 rhinovirus가 아닌 바이러스 처치 전 배양을 사용하였다. 실험에서 rhinovirus와 함께 처치하는 용매나 다른 물질의 영향으로 점액유전자 발현이나 점액분비에 영향을 줄 수 있기 때문에 불활성화 rhinovirus 처치를 대조군으로 하는 것이 바람직하다. 또한 감기 바이러스 처치 후 기존에 존재하던 점액이 바로 분비되는 양과 새로 만들어져 세포 밖으로 분비되는 것, 세포 안에 남아있는 점액 등이 있으므로 점액을 측정하려면 이 모두를 측정하는 것이 바람직하다. 다른 연구에서 rhinovirus-14를 이용하여 사람기관상피세포와 점막하선세포에서 점액유전자를 측정하였을 때 MUC5AC, MUC5B, MUC6 유전자가 기관상피세포에서 증가하였고 점막하선세포에서는 MUC5AC, MUC5B, MUC7 유전자가 증가하였으며 이러한 발현증가는 처치 후 4시간에 가장 현저하였고 24시간에는 별다른 차이가 없었다.¹⁷⁾ 본 연구의 결과와 다른 이유로는 rhinovirus형이 본 연구에서는 16형이었고 이전 연구는 14형이었던 점을 들 수 있겠다. 다른 연구¹⁶⁾와 비교해보면 같은 사람기관세포배양을 이용하였으나 rhinovirus의 형이 16형이었던 경우에는 20시간 이후에 MUC5AC 유전자가 증가하였던 반면에 14형이었던 경우는 24시간 후에 발현증가가 관찰되지 않았다. 본 연구도 16형을 사용하였고 24시간에 발현증가가 관찰된 것으로 보아 바이러스의 형이 영향을 주었을 가능성이 있다. 또한 처치 시간도 14형을 이용한 연구에서는 1시간 처치 후 세척하였고 본 연구에서는 4시간 처치 후 세척하였으며 16형을 이용한 다른 연구¹⁶⁾에서는 20시간 동안 계속 바이러스 처치를 하였으므로 처치 시간에 따른 차이일 가능성도 있다.
   MUC8 유전자는 비용상피세포에서 과발현되고¹⁸⁾ 배양된 정상 기도 상피세포에서 감염에 의해 가장 많이 발현 조절을 받는 점액유전자이다.¹⁹⁾ 따라서 rhinovirus에 의한 MUC8 유전자 발현의 증가는 점액유전자의 방어기전 중 하나로 기도에 침입하는 바이러스로부터 물리적 방어벽을 형성하고 기도상피를 보호하는 역할을 함을 의미한다.
   이러한 점액유전자 발현 증가의 기전으로 rhinovirus 감염 후 분비세포의 분화 및 세포증식, 기도상피세포에서의 싸이토카인 분비, 염증세포 모집, NF-kB(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells) 등의 신호전달 과정 등이 있을 수 있으나 이에 대하여는 향후 추가연구가 필요하다. 또한 점액유전자 발현 증가가 방어기전의 일부로 코감기 증상이나 rhinovirus의 복제 등을 막고 기도상피의 손상을 적게 하는 역할을 하는 지 아니면 코감기 증상을 악화시키고 회복에 방해가 되는 지에 대해서도 추가연구가 필요하다. 코감기에 걸린 경우 점액유전자 발현 증가가 개체에 불리하게 작용한다면 점액유전자의 발현을 억제하는 것이 치료에 도움이 될 가능성이 있겠다.

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