Address for correspondence : Myung-Koo Kang, MD, PhD, Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, Dong-A University College of Medicine, 1 dongdaesin-dong 3-ga, Seo-gu, Busan 602-714, Korea
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서     론

   유양동 폐쇄술은 개방동 유양동 절제술 후의 공동 문제를 해결하기 위한 방안으로 사용되기 시작하여 현재는 폐쇄동 유양동 절제술 후 유양동 내의 음압 형성을 방지하여 고막의 내함낭 형성 방지, 유양동 내로의 진주종 성장 방지 및 뇌척수액 누출시의 치료 방법 등으로 사용되고 있다. 유양동 폐쇄에 사용되는 물질로 피판 뿐 아니라 지방, 근막, 연골, 골, hydroxyapatite같은 인공물질 등이 쓰이고 있다. 현재, 국소 피판 및 지방, 연골, 골 등이 널리 사용되고 있으나 자가 조직은 이용량의 제한, 공여부의 부작용 및 취급과 사용의 어려움 등의 단점을 안고 있어 이종 이식 대체물의 발전에 관심이 크며 다양한 연구가 이루어지고 있다. 
   유양동 폐쇄에 사용되는 물질 중 연골과 골조직의 경우 채취 후 술자가 사용하기에 적절한 형태로 제조하여 사용하게 되고, 분말형, 세편형, 덩어리형 등 다양한 크기의 제조가 가능하다. Hydroxyapatite의 경우 제조시 입자 크기, 입자 사이 세공(pore)의 크기와 세공률(porosity)을 다양하게 조절할 수 있으며 hydroxyapatite의 입자 구성 및 세공의 크기는 신생골 형성을 위한 조골 모세포의 성장에 중요한 인자이다. 이는 술 후 결과에 영향을 미칠 수 있으나 이에 대한 이비인후과적 연구는 드물다. 이에 다양한 입자 크기와 세공 크기 및 세공률을 가진 hydroxyapatite를 이용하여 유양동 폐쇄술을 시행한 후 신생골 형성과 폐쇄 물질의 생체 내 분해 정도 및 염증 유발정도, 이물 반응 등의 결과에 대한 비교가 필요하다. 
   이에 본 연구에서는 자가 이식 물질의 문제점을 보완할 수 있는 유양동 폐쇄 물질로서 hydroxyapatite의 사용 가능성을 살피고 입자 크기와 세공의 유무에 따른 영향에 대한 조직병리학적 비교 연구를 시행하였다. 

재료 및 방법

이식 물질

Hydroxyapatite-Mimix^®: W. Lorenz Surgical, US 
   골 형성에 대한 틀을 제공하는 골 전도 물질로 사람 뼈의 주요 구성 성분인 사칼슘인과 삼칼슘인으로 구성되어 있다. 분말로 이루어져 있으며 구연산과 혼합하여 시멘트 형태로도 사용할 수 있으나 본 연구에서는 분말 형태로 생리 식염수를 혼합하여 사용하였다(Fig. 1A). 

Hydroxyapatite-Bongros^®: (주)바이오알파 
   인체 뼈의 무기성분과 결정학적, 화학적으로 동일한 hydroxyapatite 세라믹으로 구성된 조직수복용 재료로써 뼈 결손 부위 수복, 대체용으로 사용한다. 300 μm 크기의 기공들이 입체적으로 연결되어 70% 이상의 기공률을 가져 신생골 형성을 위한 유효공간을 제공한다. 주입시 생리식염수를 사용하여 형태를 다듬는다. 입자 크기에 따라 3군으로 분류하여 각각 0.3~0.6 mm, 0.6~1.0 mm, 1.0~3.0 mm 를 사용하였다(Fig. 1B-D). 

동물 모델 및 실험 방법 
   생후 7~8주의 Preyer 반사가 있는 건강한 암컷 흰 쥐 Sprague Dawley^®를 사용하였다. 
   유양동 폐쇄에 사용한 hydroxyapatite의 입자 크기에 따라 Mimix^® 분말로 유양동 폐쇄를 시행한 경우를 1군으로 하였고, Bongros^® 입자 크기에 따라 0.3~0.6 mm, 0.6~1.0 mm, 1.0~3.0 mm를 각각 2, 3, 4군으로 하여 각 군당 10마리씩 40마리의 실험군에 대한 실험이 이루어 졌다. 
   술 전 마취를 위해 Ketamin^® 50 mg/mL와 Rompun^® 25 mg/mL를 각각 0.6~0.9 mL/kg, 0.4~0.6 mL/kg씩 복강 내로 주사하였다. 귀 후면의 털을 제거한 후 베타딘과 알코올을 이용하여 실험 부위를 소독하였다. 우측 귀 후면의 3~4 mm 위치에서 약 7 mm 길이로 피부 절개를 하고 피하 조직을 박리하여 유양동을 확인하였다. 연부조직을 깨끗이 박리하여 유양동 외벽을 노출시킨 후 드릴을 사용하여 유양동 외측 벽에 5×5 mm 크기의 천공을 만들었다. 
   유양동 외측 벽의 천공을 통하여 5~10분간 5% trichloroacetic acid(TCA)를 채워둔 후 생리 식염수로 유양동을 세척하고 현미경하에서 pick을 이용하여 유양동 내의 점막을 벗겨 제거하였다. 생리 식염수로 유양동을 세척하고 건조 시킨 후 유양동 내로 실험 물질을 충전하였다. 천공된 유양동 외벽으로 노출되는 충전물의 표면을 고르게 다듬은 후 피하조직과 피부 절개 부위를 각각 5~0 vicryl과 5~0 nylon을 사용하여 봉합하였다. 봉합 부위를 베타딘을 이용하여 소독 후 감염 예방을 위해 2세대 세파계 항생제를 복강 내로 1회 주사하였다. 
   실험 후 항온 항습 및 10시간 낮 주기와 14시간의 밤 주기가 일정하게 유지되는 적절한 조건에서 시판용 고형사료로 사육하였다. 유양동 물질 이식 3개월 후 희생하여 유양동을 채취하였다. 

표본 제작과 염색 
   채취한 유양동을 10% 중성 포르말린에 24시간 고정 후 세척하여 2주 동안 pH 7.0, 10% EDTA(ethylene-diamine tetraacetic acid)로 탈회하였다. 수술용 메스를 이용하여 유양동 장 축을 따라 절제하여 단면을 노출 시킨 후 파라핀 포매하여 조직 박절기(Leica. jung RM 2035, Nussloch, Germany)로 5 μm 두께로 잘라 표본을 제작하였다. 슬라이드는 유양동 하나당 6개씩 제작하여 각 군당 총 60개의 슬라이드에 제작하여 분석하였다. Hematoxylin-Eosin(H&E) 염색을 시행하여 이식물의 상태 및 신생골 형성 및 연조직 형성, 염증의 정도를 조사하였다. 조직 표본은 조직 사진을 찍은 후 ImageScope_v9.1.19.1569 프로그램을 이용하여 이식물, 신생골 등 특정 조직의 경계를 표시하여 면적을 계산하는 방법으로 이식물, 신생골의 면적 비율을 구하여 각 군당 평균값을 비교하였다. 

통계 분석
   통계 처리는 window용 SPSS version 17.0(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 사용하여 Kruskal-Wallis 검정을 이용하였고, 사후검정은 Turkey's B Method를 이용하였다. p값이 0.05 미만인 경우를 통계학적으로 유의한 것으로 해석하였다.

결     과

   Mimix^®를 사용하여 유양동을 폐쇄한 1군은 유양동 내를 가득 채우고 있는 hydroxyapatite(Mimix^® 분말)가 관찰 되며 유양동 내벽으로부터 중앙부를 향해 순차적으로 신생골이 형성되고 있는 양상이 관찰되었다. 신생골 형성은 전체의 15±2.21%를 차지하였고 염증 소견은 없었다(Fig. 2). 
   Bongros^®를 사용하여 유양동을 폐쇄한 2, 3, 4군은 1군에 비해 대체적으로 신생골 형성이 많았고 1군의 경우 이식물이 신생골로 대치된 양상만 관찰되는 데 비해 2, 3, 4군은 이식물과 신생골 사이에 일부 섬유조직이 형성되는 양상도 관찰되었다. 신생골이 유양동 내벽을 따라서만 형성되었던 1군과 달리 유양동 내벽과 직접적인 접촉이 없는 중심부까지 신생골이 형성되어 있었다. 형성 양상은 비연속적으로 형성된 신생골 사이에 일부 빈 공간으로 남은 부분도 관찰되었다. 입자와 기공에 따라 신생골 형성 양에 차이가 있어 2군의 경우 신생골이 전체의 40±3.53%를 차지하였으며 염증 소견이 일부 동반되었다(Fig. 3). 
   3군의 경우 신생골이 전체의 55±4.62%를 차지하였고 염증 소견도 일부 동반되었다(Fig. 4). 4군의 경우 신생골이 전체의 60±7.12%를 차지하고 있었으나 중성구 침윤을 보이는 급성 염증이 심하게 관찰 되었다(Fig. 5). 
   각 군별로 신생골 형성 양을 비교해 보면 1, 2, 3, 4군에서 순차적으로 신생골 형성양이 증가하였고 이는 3군과 4군 사이의 비교 이외에는 통계적으로 유의하였다(p=0.00). 3군과 4군은 각각 55±4.62%, 60±7.12%로 4군에서 신생골 형성이 더 많았으나 이는 통계적으로 유의하지는 않았다(p=0.102).

고     찰

   유양동 폐쇄술은 1911년 Mosher에 의해 유양동 삭개술 후 결손 부위의 상처 회복을 빠르게 한다는 보고가 있은 후 현재 개방동 유양동 삭개술 후 재건, 만성 중이염의 술 후에도 지속적인 이루가 있는 경우, 신경초종 제거를 위한 경미로 접근법 수술 후, 뇌척수액의 지속적인 유출, 측두골의 악성 종양 제거 후, 만성 중이염 또는 만성 진주종성 중이염이 있는 환자에서 인공 와우 이식을 위한 처치 등 다양한 적응증에서 사용되고 있다.^1,2) 유양동 폐쇄를 위해 이용하는 재료로는 anterior based postauricular periosteofascial flap(Palva flap), inferior based postauricular periosteofascial flap, superior based postauricular periosteofascial flap, temporalis muscle flap 등 국소 피판을 이용하는 방법이 많이 사용되며 그 외에도 자가 골, 자가 연골, 지방을 이용하는 방법이 있으며 인공 이식물인 hydroxyapatite도 관심을 받고 있다.^3,4,5,6,7,8) 이비인후과 영역 외에서도 자가 물질 이식에 대해 많은 연구가 이루어져 왔으며, 인공 이식물인 hydroxyapatite에 대해서도 많은 연구가 이루어지고 있으나 아직 다양한 의견들이 있는 상태이다.^9,10,11) 본 교실에서도 이개 연골 및 골편을 이용한 유양동 폐쇄술을 시행하여 그 결과를 보고한 바 있고, hydroxyapatite를 이용한 유양동 폐쇄술을 시행하고 있으나 아직 연구가 필요한 상태이다.^12,13,14)
   이에 본 교실에서는 흰 쥐를 이용하여 다양한 hydroxyapatite를 이용하여 유양동 폐쇄술을 시행한 후 이에 대한 방사선학적 및 조직학적 연구를 시행하였다. 
   신생골의 형성을 위해서는 이를 촉진하는 뼈대구조가 필요하다. 신생골 형성을 위해 세포와 영양분이 뼈대 구조 깊숙이까지 침투하면서도 중앙부 괴사조직이 발생하지 않는 것이 중요하다. 여기 관여하는 요소로 적정 수준의 기공성과 기공의 크기, 이들의 연결 구조가 중요하다.^15,16,17,18) 이런 요소에 대한 다양한 공학적 기법이 연구되고 있으며 임상 보고도 이루어지고 있으나 아직 확실한 결론이 나온 바는 없다. 본 연구에서는 기공이 없는 Mimix^® 분말과 기공이 있는 Bongros^®를 사용하여 비교하였고, Bongros^® 중에서는 기공 구조는 같으나 입자 크기가 다른 물질을 사용하여 결과를 비교하였다. 
   본 실험에서 대조군으로 시행한 동종 골과 동종 연골의 경우 골 형성 세포가 유지되어 bone marrow, germinal center가 유양동 내부에서 나타난다. 실험 결과는 유양동 폐쇄 후 3개월 째, 동종 골의 경우 염증 유발 없이 편골(woven bone) 형태의 신생골이 전체 유양동 중 50~60%를 차지하고, 동종 연골은 역시 염증의 유발이 없으며, 이식된 연골이 남아있으면서 연골 주변으로부터 골조직으로 변화해가는 양상으로 신생골이 형성되는 양상도 관찰되며 신생골의 양은 동종 골의 경우보다 약간 작아 전체 유양동 중 35~45%를 차지하고 있었다. 
   Hydroxyapatite는 자가 골 이식에서와 같은 살아 있는 골세포에 의해 직접 골 유도효과는 없으나 신생골 형성에 있어 골 전도체로 효과적인 역할을 수행한다. 또한 hydroxyapatite 같은 인공 이식물의 경우 공여부 문제를 피할 수 있으며 취급과 사용이 용이하며 자가 물질과 달리 양의 부족함이 없으며 술 중 다른 처치가 필요 없이 즉시 사용가능 하다. 현재 사용 가능한 hydroxyapatite는 다양한 종류로 구성되어 있으며 이들의 형태 및 사용 방법, 미세 구조에 있어 다양한 차이가 있으며 그런 요소들에 의해 유양동 폐쇄술에 미치는 효과가 달라지므로 이에 대한 연구가 필요하여 본 연구를 진행하였다. 
   본 연구에서 유양동 폐쇄술의 재료로 사용한 Mimix^®는 골 형성에 대한 틀을 제공하는 골 전도 물질로 사람 뼈의 주요 구성 성분인 사칼슘인과 삼칼슘인으로 구성되어 있는 분말 형태의 물질이다. 수술시 적당한 양을 취하여 다듬어 사용하며 유양동 후벽의 재건이나 두개저 재건 등 즉시 물리적 강도를 유지하여야 하는 부분에서는 구연산과 혼합하여 시멘트 형태로 사용할 수 있지만 유양동 폐쇄술에서 시멘트 형태로 사용할 경우 기공 형태를 유지할 수 없는 단점을 가진다. 또한 자가조직을 채취하여 사용하는 경우 자가조직의 상태에 따라 치료효과가 상이할 수 있어 수술 결과의 예측이 어려운 부분이 있으나 재조 물질인 Mimix^®의 경우 일정한 경과를 취하여 결과의 예측이 쉽다.
   Bongros^®의 경우 hydroxyapatite 세라믹으로 구성된 0.3~3.0 mm의 단면을 가진 입자로 300 μm 크기의 기공들이 입체적으로 연결되어 70% 이상의 기공률을 가진다. Mimix^®와 마찬가지로 동종골이나 이종골 처럼 뼈의 상태에 따라 치료 효과가 상이하지 않아 수술 결과의 예측이 쉽다. 또한 기공 구조로 물리적 강도가 필요한 부분에서는 단점으로 작용할 수 있지만 유양동 폐쇄술 같이 압력을 받지 않는 공간에서는 분말 형태와 달리 골세포와 간질이 자라 들어올 수 있는 유효 공간을 제공한다. 
   합성 골 대체 물질이 생체 내에서 탄산 칼슘인을 형성하고 콜라겐, 섬유 구조들과 함께 신생골이 형성되는 과정에서 골 대체 물질의 구성 성분뿐 아니라 정제 정도, 농도, 기공성, 결정성 등 다양한 성질이 영향을 준다.¹⁹⁾ 본 연구에서 사용된 hydroxyapatite의 경우 어떤 구조가 신생골 형성에 좋은지에 대해서 이견이 있으나, 기공 구조를 가진 형태와 기공이 없는 구조를 비교했을 때는 기공 구조를 가진 형태가 더 용이하게 신생골과 유합되고 신생골 형성량도 더 많다고 알려져 있다. 이는 hydroxyapatite 표면에 조골세포의 부착 및 형성이 용이하기 때문으로 생각된다.^20,21) 본 연구에서 기공 구조가 없는 Mimix^® 분말 형태에서는 유양동 내벽과 접합하는 부분에 국한되어 신생골이 형성되었으나 기공 구조를 가진 Bongros^®는 유양동 중심부까지 침투하는 양상으로 신생골이 형성되며 신생골의 양도 Mimix^®에 비하여 많아 유양동 폐쇄술에 있어서 기공구조의 hydroxyapatite를 사용하는 것이 유용할 것으로 생각된다. 
   골 조직의 치료 및 재생을 위한 지지체는 골세포의 부착, 증식, 분화 활성에 도움을 주어야 하며 이를 위해 골세포 증식과 골 조직 형성이 원활한 다공성 구조이어야 하고 이 기공들의 상호 연결성이 좋아야 한다. 또한 주변 골 구조와 넓게 단단히 접촉할수록 신생골 형성이 촉진되므로 골 대체물의 입자 크기는 작을수록 주변 골 구조물과 접촉 범위가 넓어져 좋다고 알려져 있다.^18,20,22)
   Hydroxyapatite가 시멘트나 분말의 형태로 사용될 경우에는 술 중 다루기 용이한 면도 있고 유양동 내를 빈틈없이 채울 수 있는 장점이 있으나 이런 기공 구조를 가지지 못하게 된다. 본 실험에서도 Mimix^®를 사용한 그룹에서는 전산화 단층 촬영상 가장 유양동 폐쇄가 잘 되어있었다. 그러나 조직 표본상 유양동 내벽에서부터만 신생골 형성이 가능하고 이로부터 순차적으로 중앙부로 신생골 형성이 진행되므로 신생골 형성에 상당한 시간이 소요되며 본 연구에서도 유양동 폐쇄를 시행한 Mimix^®의 15% 정도만이 신생골로 대체되어 있었다. 그러나 염증 반응이 거의 없고 골 조직 이외의 섬유조직 등의 형성은 거의 없어 물질 자체는 이물 반응 및 염증 반응을 거의 일으키지 않는 안전한 물질로 생각된다. 
   이에 비해 기공을 가진 Bongros^®는 입자 크기에 따라 40~60%까지 유양동 내 신생골이 형성되는 결과를 보여 빠른 신생골 형성 효과를 보였다. 이는 기공 구조로 인해 골 형성 세포 및 간질 조직이 이식물 내부까지 진행할 수 있었던 결과로 신생골 형성이 유양동 내벽 근처에 그치지 않고 유양동 중심부까지 건너뛰며 형성되는 양상으로 나타났다. 입자 크기가 클수록 신생골 형성의 정도가 더 많았는데, 이는 기공의 상호 연결성이 잘 유지됨으로써 생긴 결과로 생각된다. 그러나 염증 반응 및 섬유 구조의 형성도 많았고 Bongros^®가 흡수되어 빈 공간으로 나타나는 모습이 관찰되어 부작용도 많은 것으로 보인다. 빠른 신생골 형성과 회복이 유양동 삭개술 후 중요한 부분이기는 하지만 술 후 감염이나 재발 없는 회복의 부분에 있어서 더 연구가 필요할 것으로 보인다. 
   또한 본 연구에서는 12주 결과로 감염이나 이물 반응을 살피기에는 기간이 긴 면이 있으며 신생골 형성도 많이 되어 초기 반응을 보기에 기간이 좀 긴 면이 있어 이후 단기 결과에 대한 연구가 필요해 보인다. 

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